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具有结肠癌抗癌活性的甲基硒代阿司匹林类似物的新剂型

发表于:2021-12-14   作者:admin   来源:本站   点击量:9722

原文:Ruberte A C , Gustavo González-Gaitano,  Sharma A K , et al. New Formulation of a Methylseleno-Aspirin Analog with Anticancer Activity Towards Colon Cancer[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(23):9017.
翻译:
具有结肠癌抗癌活性的甲基硒代阿司匹林类似物的新剂型
摘要:阿司匹林(ASA)由于其化学预防和化学治疗作用引起了世界范围内众多科学家的广泛兴趣,尤其是在结直肠癌(CRC)中。与没有硒原子的有机物相比,将硒(Se)原子并入ASA大大提高了它们在大肠癌中的抗肿瘤活性,例如有前途的抗肿瘤甲基硒ASA类似物(1a)。然而,由于化合物1a的溶解性和挥发性较差,其在癌细胞中的功效受到影响。因此,1a是由天然的α-,β-和γ-环糊精(CD),改性的β-环糊精(羟丙基-β-CD,HP-β-CD)和普朗尼克F127 配制而成的,所有这些都是无毒的,可生物降解的,FDA批准的。1a的水溶性通过β-、HP-β- CDs和普朗尼克F127得到增强。化合物1a与CDs形成包合物,并被纳入F127胶束的疏水核心。在这里,我们评估了1a单独或与β-、HP-β- CDs和普朗尼克F127合用对CRC细胞的细胞毒性潜能。值得注意的是,1a制剂对结直肠癌细胞具有更持久的抗肿瘤活性。因此,β-、HP-β- CDs和普朗尼克F127可能是改善具有溶解度问题和挥发性的有机硒化合物的药理学性质的优良载体。
1.简介
阿司匹林(ASA)是一种广泛用于各种适应症的药物。在过去的十年中,ASA因其良好的化学预防和化疗效果,特别是对结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的治疗,受到了世界范围内众多科学家的关注。多项临床研究表明,低剂量ASA可预防结直肠癌,降低其发生率和转移风险。然而,长期服用ASA会导致严重的胃肠道副作用。因此,为了提高ASA的疗效,人们做了大量的工作来优化ASA。
另一方面,在非甾体抗炎药(NSAIDs)中加入硒(Se)与不含硒功能的有机药物相比,已被证明极大地提高了它们的抗肿瘤功效。值得注意的是,硒的抗肿瘤功效取决于其代谢转化为单甲基化硒的速率,如硒的抗肿瘤活性。因此,许多CH3SeH前体被设计和合成,如甲基硒酸,对几种癌症,特别是CRC有抑制作用。利用这些原理并遵循基于片段的设计,我们的研究小组确定了一种很有前景的抗肿瘤甲基硒基ASA类似物(2-([甲基Selanyl]羰基)苯基乙酸酯,1a),它是一种假定的活性甲基硒醇(CH3SeH)前体(图1)。通过NaHSe与邻乙酰水杨酰氯反应,一锅合成了一种很有前途的抗肿瘤药物,然后用碘甲烷对中间体进行甲基化。根据美国国家癌症研究所(NCI)人类肿瘤细胞系筛选结果,化合物1a对60个细胞系的平均细胞生长抑制值为54.63%。此外,在我们的实验室中,溶解在二甲基亚砜中的衍生物1a在CRC中的IC50值低于2μM,但二甲基亚砜不能在临床环境中用作载体。然而,它的水溶性很小,而且这种类似物由于其挥发性,在癌细胞中也会失去功效。因此,1a需要在不影响疗效的前提下开发临床相关的制剂。

为了进一步开发这种类似物,我们建议通过载药技术来解决其限制屏障,从而增加其水溶性并使其延长释放形式,从而提高其生物利用度和对癌细胞的有效性。在这种情况下,环糊精(CDs)是这是小分子最常用的运载方法之一。CDs是一种环状寡糖,由6、7或8个葡萄糖单元(分别为α-、β-或γ- cd)通过α-1,4个糖苷键连接形成天然的分子锥形容器,具有轻微疏水性空腔和亲水性外部部分。因此CDs可与疏水药物通过非共价相互作用形成宿主-客体包合物,提高药物的水溶性和稳定性。值得注意的是,多项临床前研究证实这些包合物也可以提高抗肿瘤药物的疗效。
另一方面,聚合物胶束也作为纳米载体出现,以提高细胞内药物积累和药物疗效。Pluronic®系列表面活性剂(巴斯夫)是线性三嵌段共聚物,其中两个亲水聚环氧乙烷(PEO)嵌段通过疏水聚环氧丙烷(PPO)嵌段连接。它们的两亲性显著依赖于EO或PO单体的数量。它们对atp结合盒的药物外排转运体的过表达表现出抑制活性。此外,一些临床前研究已经证明这些结构物可以增强化疗药物的疗效,如阿霉素。
因此,1a用不同类型的CDs配制(β-CD, α-CD, 2-羟丙基-β-CD(HP -β-CD和γ-CD)和普朗尼克F127,一种核壳两亲性嵌段共聚物胶束。通过nmR和紫外可见光谱对这些药物结构进行了表征。我们评估了
1a对CRC的细胞毒性,无论是单独的还是被CDs或普朗尼克F127包裹的。同样,我们研究了这些载体技术对挥发物活性片段(可能是CH3SeH)的体外保存和释放能力。简而言之, β-CD、修饰的HP-β- CDs和普朗尼克F127已被证明是改善1a药理特性的优良载体。
2.结果与讨论
2.1 1a的水溶性
化合物1a由核磁氢谱显示出很差的水溶性(2.20*10-4 M)(图S2和S3)。因而,在室温下,我们将1a与活性的CDs(α-CD、β-CD或γ- CD)和修饰的HP -β-CD,普朗尼克F127结合。在所有这些CDs中,只有β-CD和HP -β-CD改善了药物的溶解性(图S4-S6),提高到了6倍(分别为1.37*10-3 M,1.46*10-3 M在CD浓度为4.15*10-3 M,4.17*10-3 M)。同样,普朗尼克F127也增加了溶解度(1.17*10-3 M,在1%表面活性剂下)。
2.2 配方的表征
2.2.1 1a的表征:CDs配合物
通过1H-NMR谱证实了1a与CDs形成包合物,因为在CDs中加入客体总是会使腔内质子的化学环境发生一些变化。具体来说,在D2O中向β-CD中加入1a会导致H-5质子的前场位移,这与CD腔中药物的加入是一致的(图2A,B)。这一包合物也通过ROESY-NMR谱得到了证实,表明β-CD内部的H-3和H-5质子与1a的H-2、H-4、H-3和H-5芳香质子之间存在较强的交叉峰(图3)。这些结果清楚地证明了1a的芳香环位于大环的空腔内。1a与HP-β-CD的包合物通过1H-NMR表征,1a:HP-β-CD在重水中的不同摩尔分数(图4A,B)。得到的光谱显示了1a乙酰质子化学位移的上电场变化。这一发现证实了1a乙酰质子与HP-β-CD的结合,使得这种相互作用与1a: β-CD络合物的相互作用非常不同。
采用了Job’s plot方法,利用质子位移来确定化学计量,根据r = 0.5时曲线峰值的摩尔比,两CDs的化学计量比为1:1(分别见图5A、B)。
包合物也能深刻改变客体分子的物理化学特征,如其在紫外-可见光谱中的吸光度、荧光发射等。在这种情况下,1a的荧光光谱(2.2*10-4 M)被记录在没有和存在的CDs。在这两种大环条件下,1a的荧光发射均显著增加(图6A,B),并伴随着波段的红移(约10 nm),证实了1a环境的微极性发生了变化由于CD腔内的夹杂物。
我们还研究了1a的紫外吸收光谱 (2.2*10-4 M)随着β-CD和H-β-CD浓度的增长(升高到1:30摩尔比)。光谱显示,在240 nm处,不同寡糖浓度的最大吸光度差异不大,但显著(图7A,C)。这些变化可用于确定配合物1a:CDs的结合常数Kb,根据240nm处DA数据的非线性回归,作为CD浓度的函数(图7B,D)。1a: β-CD和1a:HP-β-CD络合物的缔合常数分别为306 +1和458 + 9,表明1a的HP-β-CD浓度略高于β-CD。





2.2.2普朗尼克F127胶束对1a的影响
基于PPO和PEO嵌段共聚物的聚合物胶束强烈地受温度和浓度的影响,这意味着低水溶性药物的表面活性剂的负载能力。从这个意义上说,核磁共振是一种非常合适的技术来研究自聚集现象和小分子在胶束中的增溶作用。图8显示了F127在重水中的1H-NMR光谱在不同浓度下(27℃和37℃时)在没有和存在1a的情况下的展开图。共聚物最相关的信号是PPO嵌段甲基的3.73 ppm处的双峰(图8A–C)和1.20 ppm处的强单峰,对应于聚合物的质子PEO块的亚甲基(图8D-F)。首先聚焦于不含1a的表面活性剂,并考虑到温度效应,两组信号在加热时向上移动(当从27℃传递到37℃时,甲基质子为0.11 ppm,图8A–C,亚甲基质子为0.06 ppm,图8D–F)。这种转变可以用单体自聚形成胶束时发生的块脱水来解释,这涉及到相应质子的磁环境的变化。这种脱水对于形成胶束核心的PPO块更为显著,因为它比PEO具有更高的疏水性。关于给定温度下的浓度效应,Pluronic F127的胶束化程度较高,为5%(w/v),而需要较少的表面活性剂浓度,即1%(w/v),以便在37℃下形成胶束(图8B,E,蓝线)。

在药物存在下,1a共振的变化反映了不同的磁环境。在37℃(胶束完全形成)下,1a和1%(w/v)F127的扩展1H-NMR光谱在2.5 ppm处显示出强烈的单重态峰,归属于1a的甲基硒(Se-CH3)基团的质子(图8H,蓝线)。此外,图S7中收集了相同条件下1a的芳香信号。随着表面活性剂浓度的增加,共振向上移动,证实了聚合物和药物之间的相互作用。在NOESY光谱中观察到的PO单体的甲基质子和1a的两个甲基(甲基硒基和乙酰基)之间的交叉峰证实了药物主要位于疏水核心(图9),这证明了当与共聚物调配时,药物在水中的溶解度增加。

2.3 对CRC细胞的抗肿瘤活性
溶解于二甲基亚砜中的1a已被证明对CRC细胞有效。然而,二甲基亚砜不能作为载体用于临床,1a的水溶性很低。因此,在24、48和72h用MTT法对溶于水的药物构建体在体外对大肠癌细胞(HT-29、HCT-166、RKO、Caco-2)进行评价。选择大肠癌细胞是为了涵盖不同的特征,包括对5-氟尿嘧啶和奥沙利铂(HT-29)的敏感性,野生型p53表达(RKO),以及转化生长因子β-1和-2(HCT-116)和维甲酸结合蛋白I和维甲酸结合蛋白II(Caco-2)的表达。每个细胞系和时间点的剂量反应曲线如图10和11所示。对于RKO细胞,当形成CD包合物或加入F127聚合物胶束时,即使在24小时,1a的细胞毒性潜力也会提高。考虑到RKO是唯一显示这种行为的CRC细胞系,需要进一步的研究来解释这种意外的结果。这可能是因为该细胞系是被评估的结直肠癌细胞中分化程度较低的细胞系。相反,对于其余的结直肠癌细胞系(HT-29、HCT-116和Caco-2),1a的细胞毒性在24小时下降,尽管细胞毒性在72小时恢复。这一事实可以解释为1a或某些活性挥发物(如甲基硒醇)在与CDs或F127调配时释放较慢。因此,用CDs作为载体或溶解在聚合物胶束中,可以延长药物在肿瘤中的细胞毒活性,提高1a类似物的敏感性。值得注意的是,复合物1a: β-CD比HP-β-CD具有更高的细胞毒性活性,这与HP-β-CD具有更高的单位常数相一致。最后,HT-29细胞系是最敏感的CRC细胞系,并被选为研究1a本身可能的活性挥发物的定性释放。


2.4 释放研究
使用MTT分析法(图S1)在三次(24、48和72小时)和三种浓度(50、25和10μM)下对单独或配制的1a挥发性成分向HT-29细胞系的体外释放进行定性评估。结果以细胞生长百分比表示(图12)。有趣的是,单独使用1a对邻近处理井的HT-29细胞显示出很高的细胞毒活性。这一观察证实1a是活性挥发性成分的前体。值得注意的是,当用CDs或Pluronic F127配制的1a处理细胞时,其对相邻孔上细胞的细胞毒性潜能降低,表明活性挥发性片段释放减少(图12)。复合物1a:β-CD的挥发物释放量高于1a:HP-β-CD,可能是因为其亲和力常数较低(图12)。1a:F127显示出对相邻孔中细胞的最低细胞毒性活性。

3.讨论
在文献中,许多非甾体抗炎药释放衍生物已被开发和表征。因此,释放磷酸、HS、NO和NOSH的非甾体抗炎药具有很强的细胞毒活性对不同的癌细胞。仅考虑阿司匹林,NO和磷酸释放类似物作为抗结直肠癌的抗肿瘤药物脱颖而出。尽管如此,化合物1a是第一种硒阿司匹林释放剂,在HT-29、HCT-116和Caco-2 CRC细胞系上显示IC50值在0.9到2.2μM之间。
含有硒的非甾体抗炎药的报道很少,与非修饰非甾体抗炎药相比,它们的抗肿瘤活性都有显著提高。尽管它们的IC50值都与化合物1a相当,但这种新的se -阿司匹林类似物具有很大的优势,因为它能够通过释放活性挥挥物影响未处理细胞。这一关键特征可能代表了一个巨大的优势,不仅可以治疗原发肿瘤,也可以治疗远处的转移性病变,这一概念还有待验证。用化合物1a治疗肿瘤不仅可以影响肿瘤表面的细胞,还可以影响肿瘤内部的细胞。
任何小分子的翻译命运取决于它在临床相关制剂中的封装效率。因此,为了将化合物1a推进临床前体内评价,作为未来可能的临床研究的前奏,我们设计了几种制剂,旨在通过治疗实现活性挥发物的更持久释放。以前,我们的研究小组使用Pluronics和Tetronics来增加非常疏水的硒二唑的水溶性,得到了最佳的结果。然而,据我们所知,这是第一次甲基硒释放化合物是制定与环糊精和Pluronics。新配方的甲硒基阿司匹林类似物比母体化合物1a表现出更大的特征,因为细胞毒性活性持续时间过长,从而提高了其在可能的临床评估中成功的机会。虽然这项研究只是在初步阶段的发展和广泛的研究仍然需要,我们认为这些配方有潜力的临床开发。
许多临床研究已经用环糊精和Pluronics F127进行,表明这两种载体都适合临床开发。因此,我们为这些制剂的最终临床开发提出以下几组进行比较:(1)环糊精、Pluronics和1a单独,(2)磷酸、H2S和NO释放阿司匹林的实例,(3)作为甲基硒醇前体的甲基硒酸。
5.结论
综上所述,考虑到甲硒基阿司匹林类似物1a具有很好的抗肿瘤活性,但由于其溶解性和挥发性而失去疗效,该类似物是由天然的α-,β-和γ-CD和改性的β-CD(HP-β-CD)配制而成的。1a的溶解度在β-CD和HP-β-CD以及Pluronic F127的作用下提高了6倍,这是由于与β-和HP-β-CD以1:1的化学计量比形成包合物,结合常数(Kb)分别为306和458。此外,1a还与Pluronic F127的聚合物胶束调配,这也增加了溶解度,将药物并入胶束的疏水核心。在这两种情况下,1a对结直肠癌细胞系的抗肿瘤作用更持久,可能是由于其溶解度增加、释放较慢以及活性挥发物释放减少所致。因此,天然的β-CD、改性的HP-β-CD和Pluronic F127可以作为改善有机硒化合物的药理学性质的有希望的载体,这些化合物通常存在溶解性和功效问题。


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