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黑树莓花青素靶向调控miR-338-5p/SIRT1 相关信号通路对结直肠癌的化学预防作用
发表于：2019-01-02 作者：admin 来源：本站 点击量：17568
郭 君 1，毛丽萍1，李倩倩1，张秋华2，李晓龙3，毕秀丽1*
1. 辽宁大学生命科学院生物技术系，辽宁沈阳 110036
2. 辽宁中医药大学基础医学院药理系，辽宁 沈阳 110847
3. 深圳福山生物科技有限公司，广东深圳 518000
摘 要：
目的：研究 miR-338-5p/SIRT1 相关信号通路在黑树莓花青素化学预防结直肠癌中的作用。方法：小鼠分为健康对照组，氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎症相关性结直肠癌小鼠模型组，AOM/DSS 诱导联合黑树莓花青素处理组。利用miRNA 基因芯片筛选差异表达miRNAs，选miR-338-5p，采用RT-qPCR 确认miR-338-5p 在小鼠结肠组织及在人结直肠癌细胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 中的mRNA 表达，生物信息学软件预测miR-338-5p和SIRT1 靶向调节关系。Western blotting 检测小鼠结肠组织中SIRT1 蛋白及其下游mTOR 等信号通路相关蛋白表达。结果：miRNA 基因芯片分析发现，与常规饮食的模型小鼠相比，喂食添加黑树莓花青素的模型小鼠结直肠肿瘤组织中miR-338-5p表达量显著减少，进一步研究几种结肠癌细胞系，确认了miR-338-5p 表达趋势；黑树莓花青素处理结直肠癌细胞，miR-338-5p的表达能够显著降低。生物信息学预测miR-338-5p 和SIRT1 存在靶向调节关系。机制研究发现黑树莓花青素可以促进肠上皮细胞SIRT1 蛋白的表达，并对其下游mTOR 等相关信号通路分子蛋白水平具有调控作用。结论：黑树莓花青素可能通过靶向调控miR-338-5p/SIRT1 相关信号通路而发挥对结直肠癌的化学预防作用，进而为结直肠癌提供新的化学预防策略。
目的：研究 miR-338-5p/SIRT1 相关信号通路在黑树莓花青素化学预防结直肠癌中的作用。方法：小鼠分为健康对照组，氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的炎症相关性结直肠癌小鼠模型组，AOM/DSS 诱导联合黑树莓花青素处理组。利用miRNA 基因芯片筛选差异表达miRNAs，选miR-338-5p，采用RT-qPCR 确认miR-338-5p 在小鼠结肠组织及在人结直肠癌细胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 中的mRNA 表达，生物信息学软件预测miR-338-5p和SIRT1 靶向调节关系。Western blotting 检测小鼠结肠组织中SIRT1 蛋白及其下游mTOR 等信号通路相关蛋白表达。结果：miRNA 基因芯片分析发现，与常规饮食的模型小鼠相比，喂食添加黑树莓花青素的模型小鼠结直肠肿瘤组织中miR-338-5p表达量显著减少，进一步研究几种结肠癌细胞系，确认了miR-338-5p 表达趋势；黑树莓花青素处理结直肠癌细胞，miR-338-5p的表达能够显著降低。生物信息学预测miR-338-5p 和SIRT1 存在靶向调节关系。机制研究发现黑树莓花青素可以促进肠上皮细胞SIRT1 蛋白的表达，并对其下游mTOR 等相关信号通路分子蛋白水平具有调控作用。结论：黑树莓花青素可能通过靶向调控miR-338-5p/SIRT1 相关信号通路而发挥对结直肠癌的化学预防作用，进而为结直肠癌提供新的化学预防策略。
关键词：黑树莓；花青素；结直肠癌；miR-338-5p；SIRT1；化学预防
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2018)04 - 0853 - 06
微小 RNA（micro RNAs，miRNAs）是在动植物中发现的一个大小为19～25 bp 非蛋白质编码的小分子RNA 家族。通过与靶基因mRNA 作用，使其在转录后的翻译过程被抑制或直接被降解致其蛋白表达水平降低，从而参与多种生物学过程，如细胞发育、增殖、分化、凋亡以及代谢等[1-3]。miRNAs也可以发挥癌基因或抑癌基因作用参与人体多种肿瘤的发生和发展。结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家报告的发病率最高，其发病率在我国呈现上升趋势。研究发现，多个miRNAs 在结直肠癌中表达异常，在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用。过表达miR-155-5p 可增加结肠癌增殖和侵袭能力[4]。miR-433 通过调节结直肠癌中的结直肠癌转移相关基因1（MACC1）来降低细胞活力并促进细胞凋亡[5]。miR-338-5p 为miR-338 的亚型之一，miR-338 及其亚型在胃癌[6-7]和神经母细胞瘤[8]中表达下调，在宫颈癌[9]和胰腺癌[10]中高表达，在结直肠癌中，Sun 等[11]发现miR-338-3p 低表达，通过作用于SMO（smoothened，一种原癌基因）抑制结直肠癌的细胞增殖。在肝癌中，有研究发现miR-338-5p 表达上调，可以作为肝细胞癌生物标记物[12]。但是miR-338-5p 在结直肠癌中的研究较少。
黑树莓（black raspberry，BRB）属蔷薇科勾悬子属浆果，是北美膳食中食用量较大的水果，在我国其作为水果也越来越多的受到人们的喜爱。研究证明黑树莓中含有大量的活性物质，如酚酸类、黄酮类、原花青素和鞣质等酚类化合物[13]。酚类化合物已被证实具有促进脂类代谢及自由基清除等生理作用，人们已经获得证据表明酚类化合物在预防人类某些疾病方面有一定功效，如预防心脑血管疾病、癌症等方面[14]。前期研究证明黑树莓中原花青素和鞣花酸类含量丰富，对于癌症的预防有很好的作用，尤其对结直肠癌[15-16]、食管癌[17]等有一定的预防及治疗作用。但是黑树莓能否通过影响miRNAs 表达发挥对结直肠癌的预防作用尚未见报道。本研究利用化学致癌物氧化偶氮甲烷（AOM）/葡聚糖硫酸钠（DSS）联合诱导的炎症相关性结直肠癌小鼠模型，饮食给予黑树莓花青素，考察黑树莓花青素对结肠组织和结直肠癌细胞中表达异常的miRNAs 的影响，选定miR-338-5p 进行后续研究，初步探索miR-338-5p 在结直肠癌化学预防中的作用机制。此研究将为黑树莓的肿瘤化学预防作用和作用机制提供新的理论依据，miR-338-5p 的研究有望成为结直肠癌的化学预防新靶点。
1 材料
1.1 实验动物
C57 小鼠雄性，体质量18～22 g，辽宁长生生物技术有限责任公司，合格证号SCXK-（辽）-2015-0001。
1.2 实验细胞
10 代以内人结直肠癌细胞株Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480，来源于中国科学院北京协和肿瘤医院。
1.3 主要试剂
MiRNA cDNA Synthesis Ki（t CW2141，25Rxns）、miRNA Real-Time PCR Assay Kit （ CW2142 ，100Rxns）购自北京康为世纪生物科技有限公司；Anti-SIRT1 抗体（D121218-0200）、Anti-SIRT3 抗体（D221219-0200）、Anti-HIF-1α 抗体（D262108-0010）购自上海生工生物有限公司；Anti-β-actin 抗体（AB10024 ） 购自BBI 公司；Anti-VEGF 抗体（GTX102643）购自GeneteX 公司；Anti-E-cadherin抗体（3195s）购自Cell Signaling Technology 公司；Anti-mTOR 抗体（BS3611）购自Bioword Technology公司；Trizol（B900044-100）购自BBI 公司；RIPA裂解液（R0010）购自索莱宝生物科技有限公司；AOM（A5486）和DSS（42867）购自Sigma 公司。
1.4 主要仪器
Applied Biosystems 7500 实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司；高速冷冻离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；化学发光仪购自以色列DNR公司。
2 方法
2.1 黑树莓花青素的提取
黑树莓花青素由天津尖峰天然产物提取有限责任公司提取（批号20130901），质量分数＞90%。提取步骤简述如下：冷冻干燥的黑树莓冻干粉在35 ℃用乙醇-水（75∶25）萃取3 h，得到粗酚提取液。将所得提取物滤过，色谱分离，经Sephadex 进一步色谱，通过制备型HPLC 纯化得到提纯的黑树莓花青素。
2.2 实验动物模型制备
C57 小鼠（18～22 g），适应1 周后，开始造模，首先在第1、8 天小鼠单次ip AOM（10 mg/kg），然后2% DSS 摄水进行3 个循环，即1、4、7 周分别给予2% DSS 摄水，其他时间均为正常饮水，实验周期为12 周，检测小鼠肠中的肿瘤情况以确认模型是否成功。该研究由辽宁中医药大学伦理委员会批准。模型成功小鼠分2 组，模型组为AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠（10 只），给予正常饲料；黑树莓花青素组为AOM/DSS 诱导的结直肠癌小鼠（10 只），自造模开始给予含7.0 μmol/g 黑树莓花青素饲料，直到造模结束；另取正常喂养状况良好的C57 小鼠（7 只），给予正常饲料为对照组。在第12周造模结束，将小鼠断颈处死，另取结肠组织、提取上皮细胞−80 ℃保存。7.0 μmol/g 黑树莓花青素剂量的选择参照前期研究中10%黑树莓冻干粉的剂量，结合花青素的提取比例计算而来[16]。
2.3 人结直肠癌细胞处理、收集
Caco-2、LoVo、HCT-116、HT29、SW480 细胞复苏，待细胞生长到90%贴壁时取约2×105 个细胞接种于6 孔板，每孔补充培养基至2 mL。实验分为对照组，黑树莓花青素低剂量（25 μg/mL）组和高剂量（50μg/mL）组，药物处理细胞48 h，收集细胞备用。
2.4 miRNA 基因芯片检测
取结肠组织进行 Agilent Mouse miRNA（8*60K，Design ID：070155）芯片检测，完成10 个样本检测和分析。样品总RNA 利用NanoDrop ND-2000（ Thermo Scientific 公司） 定量并经AgilentBioanalyzer 2100（Agilent Technologies）检测RNA完整性。RNA 质检合格后，对样本进行标记、芯片的杂交以及洗脱等处理，此步骤是参照芯片标准流程严格操控的。第1 步：将总RNA 去磷酸化，变性后进一步用Cyanine-3-CTP（Cy3）标记。第2 步：将标记好的RNA 纯化后与芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies 公司）扫描得到原始图像。第3 步：采用Feature Extraction软件（version10.7.1.1，Agilent Technologies 公司）处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件（version13.1，Agilent Technologies 公司）进行quantile 标准化和后续处理。最后，对差异miRNAs进行非监督层次聚类，利用热图的形式展示差异miRNAs 在不同样本间的表达模式。上述miRNA基因芯片检测分析由上海欧意公司完成。
2.5 实 时 荧光定量PCR （ RT-qPCR ） 检测miR-338-5p 的表达量
RT-qPCR 检测组织和细胞miR-338-5p 的表达量，组织及细胞用Trizol 试剂提取总RNA，参照micro RNA 逆转录试剂盒说明书行逆转录，RT-qPCR 反应采用SYBR 染料法，选用U6 作为内参基因，反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 个循环。采用2−ΔΔCt 法计算miR-338-5p 相对表达量，mmu-miR-338-5p 引物序列：5’-GAACAATATCCTGGTGCTGAGTG-3’；hsamiR-338-5p 引物序列：5’-TGAACAATATCCTGGTGCTGAGTG-3’。
2.6 生物信息学分析miR-338-5p 的靶基因
利 用 TargetScan （ http://www.targetscan.org/vert_71/）、miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）在线软件分析miR-338-5p 和沉默信息调节因子1（SIRT1）的靶向关系。
2.7 Western blotting 检测相关蛋白表达
蛋白质印迹法检测结肠癌组织上皮细胞SIRT1蛋白及其下游mTOR 等相关信号通路分子蛋白。结肠组织上皮细胞，加入RIPA 裂解液和PMSF 蛋白酶抑制剂提取总蛋白，BCA 法测定蛋白含量。20 μg总蛋白上样，12% SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，封闭，孵育一抗、二抗，凝胶成像系统拍照、分析。
2.8 统计学方法
采用SPSS 19.0 统计软件分析，组间比较采用t检验及方差分析，Image J 和Graphpad Prism 5.0进行统计做图。
3 结果
3.1 miRNA 基因芯片结果
从小鼠结肠组织miRNA 基因芯片结果发现，模型组和黑树莓花青素组的小鼠结肠组织中所有miRNAs 表达特征共发现6 个差异表达miRNAs（差异倍数＞2.5），将差异表达miRNAs 聚类分析。miR-338-5p 在模型组小鼠中高水平表达，在给予黑树莓花青素饮食12 周后，其表达水平显著下调（图1），提示miR-338-5p 在黑树莓花青素抑制肿瘤形成和化学预防中可能发挥作用。
3.2 小鼠结肠组织和结直肠癌细胞系miR-338-5p表达量
为了进一步验证miRNA 基因芯片结果。通过RT-qPCR 检测小鼠结肠组织和结直肠癌细胞系中miR-338-5p 的表达量变化。同对照组比较，模型组小鼠组织中miR-338-5p 显著上调；喂食黑树莓花青素组小鼠组织中miR-338-5p 显著下调（图2-A）。体外细胞水平，黑树莓花青素处理后结直肠癌细胞miR-338-5p 表达量同样下调（图2-B），与基因芯片结果相符。提示miR-338-5p 表达参与了黑树莓花青素结直肠肿瘤的化学预防作用。
图 1 小鼠结肠组织miRNA 芯片聚类分析模型组和黑树莓花青素组差异表达 miRNAs
3.3 生物统计软件预测SIRT1 基因是MiR-338-5p的靶基因
进 一 步 利用生物信息学软件分析预测，miR-338-5p 的种子区域和SIRT1 基因3’UTR 存在互补配对的序列（图3），因此生物信息学分析认为SIRT1 可能是miR-338-5p 的靶基因。
3.4 小鼠结肠组织上皮细胞SIRT1 蛋白及mTOR等相关信号通路分子检测
进一步对上述生物信息分析预测结果进行验证，考察了SIRT1 蛋白及其介导的下游信号通路相关分子的表达。结果（图4）发现，与模型组相比，黑树莓花青素组SIRT1 蛋白、E-cadherin 蛋白表达升高，下游相关信号通路相关分子mTOR、SIRT3、HIF-1α的表达下降。SIRT1 抑制结直肠癌的发生和发展，SIRT1 表达上调抑制mTOR 蛋白表达[18]。mTOR 可以从转录水平激活HIF-1α 的表达，所以相应的HIF-1α表达下调[19]。HIF-1α 可以通过控制VEGF 的编码基因来调节VEGF 的表达，HIF-1α 表达受抑制，相应VEGF 的表达也受抑制[20]。所以，当前研究提示黑树莓花青素可以通过影响miR-338-5p，进而调控SIRT1蛋白的表达，调控结直肠癌的发生发展。
3.5 黑树莓花青素在结直肠癌中发挥化学预防作用的机制
经过上述实验验证，推测在结直肠癌的发生发展中，黑树莓花青素能通过多重作用激活SIRT1 及其介导的下游相关信号通路分子来发挥对结直肠癌的化学预防作用。在此过程中miR-338-5p 作为黑树莓和SIRT1 相关信号通路的中间信使，传递黑树莓花青素化学预防作用，并通过自身的靶向功能，作用于SIRT1 相关信号通路（图5）。
经过上述实验验证，推测在结直肠癌的发生发展中，黑树莓花青素能通过多重作用激活SIRT1 及其介导的下游相关信号通路分子来发挥对结直肠癌的化学预防作用。在此过程中miR-338-5p 作为黑树莓和SIRT1 相关信号通路的中间信使，传递黑树莓花青素化学预防作用，并通过自身的靶向功能，作用于SIRT1 相关信号通路（图5）。
4 讨论
酚类化合物是植物体极为重要的次生代谢产物，由于酚类物质在预防疾病方面的发现，作为化学预防剂广泛应用，刘秀芳等[21]研究证明了茶多酚抑制结直肠癌细胞生长。杏仁中鞣花酸含量丰富，鞣花酸在诸多物质中显示出具有抗癌性，通过影响信号转导通路抑制结直肠癌细胞增殖[22-23]。黑树莓中原花青素和鞣花酸类含量丰富，在前期的研究中发现黑树莓花青素能抑制结直肠癌细胞的增殖，迁移，抑制肿瘤的发生发展[24]。本研究中，小鼠组织miRNA基因芯片研究结果及体外细胞体系深入机制研究发现：黑树莓花青素能通过下调miR-338-5p，从而激活miR-338-5p 的靶蛋白SIRT1 及其介导的下游相关信号通路分子，来发挥对结直肠癌的化学预防作用。
本研究中发现利用RT-qPCR 检测miR-338-5p在结直肠癌组织相比于正常组织表达量升高，miR-338-5p 作为癌基因发挥作用，同时生物信息学的预测发现miR-338-5p 与SIRT1 可能是有靶向关系的。SIRT-1 是NAD＋依赖性III 类组蛋白脱乙酰酶的成员，其参与多种病理生理过程，例如抗炎，调节细胞生长和代谢，抗癌发生[25-27]。SIRT1 使β-catenin 脱乙酰基，从而抑制β-catenin 的激活转录和细胞增殖[28]。SIRT3 的作用与SIRT1 相反。SIRT1的升高会降低mTOR 表达量[16]。mTOR 可以从转录水平激活HIF-1α 的表达[17]。HIF-1α 在结直肠癌增殖、侵袭和转移的发生中的表达，HIF-1α 通过控制VEGF 的编码基因从而来控制VEGF 的表达，进而促进血管生成[18]。SIRT1 能够抑制结直肠癌的发展和进展。本研究中相比于AOM/DSS 模型组，黑树莓组结直肠组织中SIRT1 蛋白表达量提高，下游mTOR 等信号通路相关蛋白表达量也发生变化，黑树莓能通过某种方式调控SIRT1 信号通路，而且黑树莓降低miR-338-5p 表达同时提高SIRT1 蛋白表达，同样证实miR-338-5p 与SIRT1 可能是有靶向关系的。
综上所述，黑树莓花青素能通过调控miR-338-5p/SIRT1 信号通路影响结直肠癌的发生发展，从而发挥对结直肠癌的化学预防作用，上述研究结果为结肠直肠癌提供新的化学预防和治疗策略。
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