最新资讯
-
电话： 400-113-6988 邮箱： dongfangxicao@163.com 地址： 深圳市南山区粤海街道高新中三道9号环球数码大厦19楼
↓ 微信扫码识别关注我们 ↓ 
关于黑树莓的癌症临床试验：过去、现在和未来
发表于：2018-12-28 作者：admin 来源：本站 点击量：6777
摘要
背景：临床前模型证实黑树莓可以抑制许多癌症的发生，包括口腔、食管、结肠、乳腺和皮肤等癌症。基于临床前试验的良好结果，研究者们针对癌症患者和癌症高危人群进行了一系列的临床试验。
目的：总结黑树莓对癌症患者和癌前病变者的治疗和预防作用的临床试验，并讨论未来的研究方向。
方法：收集、总结了2015年12月1日之前发表的关于树莓干预癌症临床试验的文献。
结果：研究分析了黑树莓在口腔、食道和结肠的癌症病变和癌前病变临床试验中有明显效果的报道。对于口腔上皮内瘤变患者，黑树莓可使不典型增生病变好转并且显著降低肿瘤抑制基因位点杂合性丢失，可以调节和RNA加工及生长因子再循环有关的基因；在结肠，黑树莓抑制家族性腺瘤性息肉病的发展，使肿瘤抑制基因去甲基化、提高血浆细胞因子水平；在巴雷特食管炎患者，黑树莓增加GST-π的组织表达水平，并减少8-异前列腺素（脂质过氧化作用/氧化应激的标志物）。
结论：虽然黑树莓用于癌症抑制的精确剂量、持续时间和最佳输送方式仍有待完全阐明，但是研究的结论证明黑树莓可以抗增殖、抗炎、降低氧化应激水平以及恢复肿瘤抑制状态。结论部分阐述了将来的发展方向。
关键词：癌症预防、黑树莓、口腔、食道、结肠、人类临床试验
1. 前言
近数十年，许多临床试验证据都支持BRB作为高风险人群癌前病变或癌症的抑制剂。首先，越来越多流行病学证据显示，基于植物类食物的饮食可降低癌症风险，尤其是上呼吸消化道癌症。第二，显著的临床前动物实验结果显示，BRB通过靶向增殖、炎症、血管生成和凋亡过程抑制口腔癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌和皮肤癌。第三，从组成成分看，黑树莓富含维他命、矿物质、纤维素、花青素、总酚类物质和其它有癌症抑制能力的生物活性成分。最后，初步研究显示，在食用BRB 1-2h后，血浆中的主要花青素和鞣花酸达到最大浓度，在30min-4h之间，尿液中达到最大浓度，其生物利用度令人担忧，只有不到1%的亲本或前体花青素被吸收。但是最近研究显示，花青素的生物利用度可比得上其它黄酮类亚类，花青素的多种代谢产物可被显著吸收，其半衰期从2小时到96小时。反过来，代谢物也可修饰细胞粘附和炎症信号级联，两个重要的癌症相关过程。
2. 材料与方法
利用Pubmed全面检索2015年12月1日前利用黑树莓临床干预癌症或癌前病变的相关文献。关键词搜索包含黑树莓、癌症、癌变前、癌前病变和临床试验，确保所有研究论文都被包含。BRB的临床研究已经完成了对癌症或癌变前的口腔、食管和结肠的试验，这里将一起做综述。综述涉及的临床试验的详细内容都汇总在每一个研究中。
3. 结果
3.1. BRB凝胶在口腔癌前病变患者中的初步研究
禁止烟草、降低酒精摄入及增加水果和非淀粉类蔬菜的消费可阻止约60%的嘴、咽和喉的癌症。在无吸烟史人群中，高水果消费可显著抵抗头颈癌症。Mallery和其同事设计了两个试验，这两个试验建立在流行病学调查基础上并将临床前研究扩展到口腔初癌患者的临床研究。试验将10% BRB 凝胶施用于口腔初癌患者，为期6周，病变范围从角化过度伴不典型增生到严重发育异常。之前已经详细介绍过凝胶的制备。简言之，凝胶含有10%凝固的干黑树莓粉末，pH值为3.5以稳定花青素分子的花色基元阳离子的生物活性。患者每天施用4次凝胶，每次约0.5g BRB。已有两篇研究详细报道了研究细节和选择标准，受试者年龄都在18岁以上且镜下确认口腔上皮癌前病变，最近未使用烟草类产品。第一和第二个研究分别调查了17例和20例呈口腔初癌的患者，及10例口腔上皮呈组织学正常的患者。在施用前切割一半癌前病变组织或正常上皮，正常组织是从腹侧舌正常组织切割。在施用BRB凝胶 6个月后，患者组织进行再次活检，包括剩余处理部位和初始活检区域。检测终点包括组织学诊断和肿瘤抑制基因位点杂合性缺失（INK4a/ARF, p53和FHIT），这两个检测指标都在口腔初癌中有变化且与鳞状细胞癌进展有关。受试者在施用BRB 6周后显示很好的耐受性，没有患者报告副作用且对照组患者的上皮正常组织仍保持正常。最重要的是，BRB 凝胶的施用导致一部分患者组织退化，杂合性缺失率在统计学上显著降低。而且，在施用BRB的受试者中，41%显示病变等级下降，23%显示组织学分级增加，剩余35%组织学分级无任何变化。
在同样的人群中进行了更深入的研究，有3个额外的病例，将结果扩展到生长因子、促炎和血管生成诱导酶类（VEGF、COX-2、iNOS），基因表达谱和微血管密度（MVD）。结果显示，一部分BRB 凝胶的施用可抑制与RNA加工、生长因子再循环和凋亡抑制有关的基因。此外，施用BRB后，COX-2水平显著下降。CD34的检测显示63.6%的患者MVD降低；同时，其余的患者MVD水平升高。这些结果都支持以下结论：BRB凝胶对病变组织退化有积极作用，可降低杂合性缺失、炎症性标志物和MVD；与其他患者相比，这部分患者对BRB的响应更强。
3.2. BRB凝胶在口腔初癌患者中的安慰剂对照研究
基于口腔初癌患者施用BRB凝胶 6周后的乐观结果，继续开展了一个扩大的持续3个月的多中心安慰剂对照试验，进一步评价其有效性。40例镜检确诊的口腔初癌患者参与试验，22例患者随机施用10% BRB凝胶，18例患者施用安慰剂凝胶。在口腔癌前病变部位局部施用BRB 凝胶（每次0.5g，每天4次）导致病变大小、杂合性缺失率和组织学分级都显著降低。相反，安慰剂凝胶组的病变大小显著增加，同时组织学分级没有增加，杂合性缺失水平也没有下降。尤其是，70.6%安慰剂组患者的病变大小显著增加；同时，76.2% BRB凝胶组患者的病变大小显著降低。施用BRB的患者中，41%在3个月后病变等级降低。研究进一步显示，对BRB有响应的患者的病变部位BRB代谢和角质形成细胞分化酶类的预处理水平较高，说明患者内在的代谢和分化能力各不相同。作者对病人之间敏感性变化的讨论为预防试验提出了新的挑战。
我们需要再做一些研究以理解基于患者个体的BRB和多酚类组分的吸收、代谢和生物活性。Kay和同事们最近使用13C标记的花青素-3-葡萄糖苷（C-3-葡萄糖），一种主要的BRB花青素，作为检测药代动力学的新方法并通过C-3-葡萄糖的吸收鉴定新的代谢物。令人意外的是，这种有针对性的标记方法显示，根据吸收的13C剂量的总排出量，花青素的最小生物利用度为12.4%。与之前报道的相比，这个水平是相当高的，同时，也证明花青素的生物利用率与其它黄酮类亚类一样有效。这个研究也报道了不同个体间C13示踪物回收的高度多变，个体间大的差异转而影响化合物的命运和患者对干预的敏感性，正如在口腔研究中提到的。对吸收、代谢和排泄的新理解来源于13C标记研究，同时也应考虑研究其它参与的多酚类组分。
此外，像口腔这样非常容易进入的位置为研究可控的直接药剂输送和患者之间敏感性变化的测定提供了一个现成的模型。它实现了按照剂量更精确的传递，易于一天多次操作，较少剂量即达到疗效且受益于局部代谢。临床前研究证明，当BRB直接与目标区域接触时可以发挥最好的疗效，也有唯一的例外，一项单独的在乳腺癌临床前模型中做的体内研究。因此，新标记方法可能用于改善抑制药物的靶向性并增强我们对不同患者敏感性的理解。
3.3. BRB在barrett’s 食管癌患者中的研究
Barrett’s食管癌（BE）是食管腺癌（EAC）中唯一已知前期病变的，一种快速上升的存活率低的癌症。胃和十二指肠内容物的回流称为胃食管反流病（GERD），是BE和EAC的主要风险因素。GERD经常表现为烧心，估计影响超过6000万美国人。此外，肥胖使BE风险增加1.5到2倍，使EAC风险增加2到2.5倍。因此，有大量人群有BE风险并潜在发展为EAC。基于富含水果、蔬菜和纤维素的植物食物饮食与EAC风险降低有关。一个6个月的初步研究评价了基于食物的化学预防方法的长期耐受性，检测了BRB是否调节氧化损伤和其它与GERD和Barrett’s食管进展相关的异常信号级联。详细的研究方法和选择标准之前已有报道。简言之，所有受试者都是18岁以上、在当前和之前2次内镜检查中诊断有Barrett’s食管（≥1cm）的成年人。20例患者参与，每例患者自己作为对照。女性和男性每天分别以32g和45g服用冻干的或冷冻干燥的BRB粉末。这个数量大约等于1.5杯和2杯水果，是基于早期动物模型临床前研究的结果，饮食中含5%和10%的BRB可抑制食管癌。患者用6盎司水混合BRB粉末，每天早晨口服混合物。服用前和服用BRB 12周和26周后检测尿液标志物。具体的检测包括8-异构前列腺素F2α（8-PGF2α）和8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）的尿排泄率，脂质过氧化标志物和氧化DNA损伤。鞣花单宁代谢物、尿石素A-葡萄糖醛酸酯、尿石素A-硫酸酯和二甲基鞣花酸葡糖苷（DMEAG）在尿液中的水平是第一次检测，作为验证的潜在标志物。在食管和胃组织中评价与增殖、分化、解毒和炎症相关的标志物变化。评价食管组织的具体免疫组化标志物包括：Ki-67、CDX2、GST-pi和NF-κB。此外，第二个结果包括组织病理、Barrett’s食管长度、血压、总胆固醇水平和体重指数的变化。
这项研究结果显示，人体对每天32g和45g、连续6个月服用黑树莓粉有很好的耐受性。并且基于摄入记录和返回的包装数量可以判断每天BRB的消费高达96%。与基线相比，BRB处理12和26周后鞣花单宁代谢物、尿石素A-葡萄糖醛酸酯的水平显著升高。在基线，15%患者表达可检测水平的尿石素A-葡萄糖醛酸酯[70ng/mL]；同时，在12周[1287ng/mL]和26周[1723ng/mL]后，85%患者表达水平都提高，说明尿石素A-葡萄糖醛酸酯可以作为附加的验证指标。BRB消费导致尿中尿石素A-硫酸酯和DMEAG水平的升高；但是，这些代谢物受影响的程度和大小都不同。代谢酶类的差异可能是造成患者之间反应多样的原因，但是需要提供进一步研究以更好的理解代谢酶类个体差异所起的作用及与患者个体肠道菌群潜在的相互作用。
BRB服用12周后可降低8-PGF2α的尿排泄，并在26周后达到统计学显著性。这个标志物被认为是可靠的且相对稳定的总氧化应激水平标志物，更具体的说是脂质过氧化的指标。考虑到6个月试验后平均BMIs显著增加，则8-PGF2gr的降低特别有意义。BRB消费不能显著降低8-OHdG的水平，一个DNA损伤标志物且以高度多变著称。在试验期间，10例患者的8-OHdG显示升高，6例患者显示下降。有趣的是，服用BRB患者的总胆固醇水平没有显著下降，尤其是那些基线胆固醇水平大于200mg/dL（p=0.165）的患者。BRB消费后，胆固醇水平从基线的234mg/dL降低到26周后的226mg/dL。后续的结果与其它最近的研究相一致，都指向浆果消费对心血管健康指标的正面作用，即使是代谢综合征患者。Jeong和同事最近报道了给代谢综合征患者服用一种BRB浓缩物12周后能显著降低总胆固醇和细胞因子包括IL-6和TNF-α水平。肥胖是BE和EAC的高风险因素；因此，正面影响风险因素和癌症进展的药物特别有希望。就组织具体变化而言，主要的正面作用就是55.6%患者的BE上皮解毒标志物GST-pi表达增强。由Ki67作为指标的总增殖率没有改变，2例患者的增值率下降，2例患者增值率上升。患者的BE组织病理等级或BE舌头的长度在服用前后没有显著变化。但是，值得注意的是BE部位的长度有一个30%或1cm的改变，这种改变需要患者样本量达到43才能观察到；因此，本研究还需要继续观察BE长度的变化。综上所述，这些结果都证明每天服用32g和45g BRB可正面影响总胆固醇的血浆代谢物并增加尿中鞣花单宁代谢物，降低尿中脂质过氧化标志物，而且组织的解毒标志物GST-pi水平显著升高。其余组织特定标志物的调控可能需要更高剂量、高频率服用次数或可替代的输送方式。
3.4. BRB在结直肠患者中的研究
美国统计的一年49000例患者中，结直肠癌（CRC）在癌症相关的死亡原因中排名第二。在过去20年，筛查和治疗方式的改进使结直肠癌死亡率下降。尽管约一半诊断为CRC的患者将最终死于疾病。因此，仍然需要更有效的结直肠癌的预防措施和治疗选择。据估计50%的结直肠癌能被预防，主要通过运动、保持健康体重、限制红肉和加工肉制品消费和食用基于植物的富含蔬菜、全谷物和水果的饮食。正面临床前试验结果证明食用BRB显著抑制化学诱导的结肠肿瘤形成。由20例结直肠癌患者参与的一项临床试验已经展开。排除和纳入标准之前已有报道。所有用于检测的组织都取自口服BRB（每次20g，每天3次）1到9周后的患者。主要检测与细胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt信号相关的标志物的变化。消费BRB 4周以上的患者呈现阳性结果。具体结果为BRB可改变癌旁正常组织中DNMT1、SFRP2、PAX6a的甲基化和结直肠组织中DNMT1、SFRP2、PAX6a、WIF1的甲基化。BRB不能诱导全基因组甲基化的改变。免疫组化染色结果显示，BRB调控结直肠组织中的β-actin、Ki-67、TUNEL、CD105、DNMT1和正常组织中的CD105、DNMT1。很多研究显示，BRB可显著改变随结肠癌变化的关键分子信号通路上的大量标志物，这是令人鼓舞的，并且这种作用在相当短时间内即发生。口服BRB 4周以上的患者的许多试验结果都是阳性的，证明即使是短期或潜在的间歇性使用癌症抑制药物也可能受益很多。
根据以上结直肠试验的结果进一步研究了BRB诱导调控的细胞因子、血浆和尿液中的代谢物。已有研究报道了患者消费浆果超过10天后GM-CSF和IL-8血浆水平有显著变化，这种变化与结直肠组织中凋亡诱导和增殖抑制有关。这些结果证明BRB可非常迅速的诱导循环标志物的改变（10天），但是组织特定的变化还需要更长时间服用BRB（4周或更长时间）或者更高累积剂量。这些结果与BE的研究结果是一致的。非靶向代谢分析发现了超过400种已注释的代谢物，其中BRB作用后，在尿液和血浆中分别有34和16种代谢物呈显著变化。BRB作用后具体的代谢通路变化包括氨基酸代谢、脂类代谢和外源性物质。BRB多酚类物质被代谢为与增强的氨基酸代谢物有关的多种苯甲酸。而且，4-甲基邻苯二酚硫酸酯水平在尿液和血浆中都升高，并在组织水平促进凋亡。
3.5. BRB在家族性腺瘤性息肉病患者中的研究
家族性腺瘤性息肉病（FAP）是一种遗传性疾病，其特征为结肠息肉病早发并在40岁时发展为结肠和直肠癌。FAP是由于APC基因胚系突变导致的，需要密切关注患者，通过内窥镜监视以早期检测到息肉。一旦监测到息肉，预防癌症唯一有效的方法是结肠切除术。因此，延迟息肉发展可能为预防方案提供选择或补充。非甾体抗炎药（NSAIDS）可使FAP相关息肉退化，但是由于有相关的肠胃道、心脑血管事件，正在研究无毒性替换策略。因此，由14例FAP患者参加的一个小规模研究用于评价BRB对息肉数量、大小和负荷的潜在有益作用。受试者每天服用BRB，为期9个月。臂1包括7例患者，服用麦芽糊精安慰剂粉末，每天3次，并结合2种BRB直肠栓剂（睡前使用，每次0.7g）。臂2包括另7例患者，服用与水混合的冷冻干燥BRB粉末（每次20g，一天3次），加上2种BRB直肠栓剂（睡前使用，每次0.7g）。具体研究细节之前已有报道。简言之，入选标准为：年龄≥18岁，基线内镜检查显示至少5个大于2mm的直肠息肉可诊断为FAP，现阶段或最近2月没有用NSAID。治疗开始前和36周后，每例患者进行可屈性乙状结肠镜检查，记录息肉数量、大小和负荷，负荷定义为所有大于2mm的腺瘤直径的总和。取两个直肠息肉用于生物标志物组织活检，并在36周后计数并切除所有直肠息肉。结果包括细胞增殖标志物Ki-67的免疫组化分析、TUNEL染色检测凋亡、cMyc、DNMT1、p16和DNA甲基化分析。
结合两个试验臂，研究结果显示使用BRB栓剂后肿瘤负荷显著下降；作者认为口服BRB的患者并没有显示更好的效果。有趣的是，与栓剂单独使用（约40%）相比，组合使用（约75%）后息肉负荷的变化幅度似乎更大，那么试验效果用幅度描述是否更好。为评价口服BRB加栓剂的效果是否强于栓剂单独作用，需要样本量大于7。当然，如口腔初癌试验所讨论的，栓剂的优势可能是依据息肉的位置做到局部释放；不管怎样，需要进一步研究以确定对于FAP患者是否口服加直接释放的组合方法更有优势。试验完成后，有3例患者的息肉数量和负荷都增加，其中1例是单独使用栓剂，2例是使用口服加栓剂的组合。对BRB治疗有响应且肿瘤负荷降低的患者还有其它变化：Ki-67检测显示细胞增殖率下降，DNMT1减少，p16水平增加，yet、cMYC和TUNEL表达没有变化。BRB处理导致p16启动子甲基化降低，但是BRB对无响应患者与有响应患者息肉中Wnt通路拮抗剂、SFRP2和WIF1的影响没有差异。此外，检测了有响应患者APC基因的SNPs差异，但没有发现任何不同。
这些鼓舞人心的结果与早期结肠癌患者的研究一致，但是也有特别之处，因为在有响应患者和无响应患者间，Wnt调节器没有差异改变。这项研究也发现有响应患者腺瘤中，调控Wnt通路的miRNA被BRB去甲基化。总之，BRB靶向结肠癌的强阳性数据显示，BRB对遗传性FAP和非-FAP相关结肠癌都有抑制效果。结果也再次证明，FAP患者群中除响应BRB暴露的患者，还有一部分不响应BRB的患者。
4. 讨论/结论
单一食物来源和癌症防护之间相关性的证据很有限。迄今为止，最有力的癌症抑制证据存在于食物组中，尤其是基于植物的富含水果、蔬菜和纤维素的饮食。在提取物方面，许多证据表明提取物越接近模拟整个植物成分，癌症防护的效果越好。为对比BRB和来源于BRB的提取物对食管癌的抑制作用，开展了一项用F344大鼠的临床前体内研究，比较5%冻干黑树莓粉末和来源于BRB的富含花青素的提取物、来源于BRB的乙醇/水溶性组分、来源于BRB的不溶性组分、来源于BRB的正己烷提取物和来源于BRB的糖组分。结果显示，含有相同水平花青素的5%BRB、花青素组分和乙醇提取物抑制NMBA诱导的食管癌的效果是一样的，说明花青素是BRB中抑制癌症的成分。但是，来源于BRB的不溶或残渣组分也接近于抑制剂，这种组分含有极低水平的花青素，说明每类食品的性质都很复杂，许多与癌症抑制有关的食物的特征没有完全分析清楚。
一项对比评价红色和黄色西红柿与相同水平的提取物番茄红素的临床试验结果显示，短期西红柿摄入可诱导血清变化，这些改变有利于调控被处理细胞中癌症相关基因的表达；同时，一些促癌基因表达的上调显示，提纯的番茄红素既有积极作用又有潜在有害作用。因此，尽管技术进步，但是对癌症抑制有响应的水果或食品基质中的主要或唯一的成分的鉴定仍是一大挑战。
尽管如此，不同黑树莓产品的临床前和早期临床研究都显示，黑树莓对目标癌症的抑制是有益的。已完成出版的临床评价BRB的研究显示，BRB对头颈、食管和结肠的癌前病变或癌症有正面作用。BRB在临床评价的正面作用包括：抗细胞增殖；促细胞死亡通路的激活；口腔上皮内瘤样病变组织退化伴随改善的组织学分级和肿瘤抑制基因相关位点LOH的显著降低，RNA加工相关基因的抑制减弱，生长因子再循环，和口腔中COX-2水平的下降；结肠患者中，FAP相关息肉发展的抑制，已知肿瘤抑制基因（Wnt通路拮抗剂和p16）的去甲基化和改善的血浆细胞因子表达谱（GM-CSF, IL-8）；Barrett’s患者中，BRB治疗后，组织水平的GST-pi增加，脂质过氧化/氧化应激减少（尿-8-异构前列腺素水平），胆固醇水平降低。此外，另一些肥胖患者的研究显示，血清细胞因子水平和血脂包括IL-6、TNF-α、胆固醇都有改善。并不是所有研究结果都是一致的，大部分结果显示，受试人群中响应者和非响应者的百分比反应了个体间的异质性和每种癌症或癌前病变的复杂性。此外，黑树莓的输送方式、传送基质、浓度、频率、周期各不相同，得到的结果也多种多样：BRB被加工成冷冻干燥粉末与水混合成悬浮液用于口服（每天37到60g），直肠栓剂直接单独使用（每天1.4g）或与口服组合（每天60g），外用剂（10% w/w）在口腔以生物粘附凝胶形式作用。对FAP或口腔初癌患者的目标区域都可以实现BRB生物活性成分的直接输送。与悬浮冻干粉末的口服给药相比，这种输送方式所用产品较少，直接接触时间增加，利用了本区域的局部代谢。总之，贯穿各研究的共同结论是，BRB以靶向方式发挥抗炎作用，可降低氧化应激，影响代谢，恢复抑瘤活性，导致口腔和结肠病变的退化。
需进一步研究为达到最佳癌症抑制效果所需BRB的精确剂量和周期，但是现有结果显示较低浓度对降低血脂有益，而在组织中发挥作用需要较高浓度。此外，从1周到9个月的试验时间长度证明，4周到3个月或以上的长期试验更有效果。有必要进一步研究以增强BRB癌症抑制机制研究，并提高我们识别适合BRB治疗的患者的能力。将来临床试验中，有一个可靠的连接摄入和效果的标志物是很重要的。BE试验涉及到鞣花单宁代谢物，但是仅有85% BE患者表达此代谢物，说明患者个体间遗传背景或代谢变化差异会导致代谢物利用方法的复杂性和局限性。将来前瞻性试验应考虑一种替代方法，对BRB产品进行食品分级，引入更精确的合规的评价。
BRB和其它多酚类物质生物利用度和代谢的研究已有一定进展，但是有更多工作需要做。Kay和同事利用13C标记方法评价施用500mg 剂量后原花青素-3糖苷在血液、尿液和粪便样本中的吸收、代谢和排泄。这项研究发现了一些新代谢物，有助于理解化合物在体内的代谢。另一些研究利用这些方法评价其它多酚代谢物，不同的基质和长期服用将更有效果。此外，还有一些有趣有效的研究主要关注基于食品的靶向癌症预防药物输送有关的新产品，可能提供可替代方式或输送基质，尤其是对于容易接近的靶标。比如，与坚硬的糖果蜜饯仅保留60%相比，主要由果胶和淀粉组成的黑树莓糕保留了93%的花青素。
总之，BRB人体临床试验证明了口腔、食管和结肠的化学预防效果。不管怎样，进一步研究是必要的且应包括1）其它更易获得的有益健康的浆果单独或与BRB组合的评价；2）整个BRB水果与主要成分和活性代谢物的比较；3）选择BRB输送方式和基质；4）影响BRB代谢和生物利用度的因素；5）BRB对癌症启动细胞或癌干细胞的作用；6）癌症发生阶段的BRB应用；7）BRB是否增强化疗或放疗的效果。
背景：临床前模型证实黑树莓可以抑制许多癌症的发生，包括口腔、食管、结肠、乳腺和皮肤等癌症。基于临床前试验的良好结果，研究者们针对癌症患者和癌症高危人群进行了一系列的临床试验。
目的：总结黑树莓对癌症患者和癌前病变者的治疗和预防作用的临床试验，并讨论未来的研究方向。
方法：收集、总结了2015年12月1日之前发表的关于树莓干预癌症临床试验的文献。
结果：研究分析了黑树莓在口腔、食道和结肠的癌症病变和癌前病变临床试验中有明显效果的报道。对于口腔上皮内瘤变患者，黑树莓可使不典型增生病变好转并且显著降低肿瘤抑制基因位点杂合性丢失，可以调节和RNA加工及生长因子再循环有关的基因；在结肠，黑树莓抑制家族性腺瘤性息肉病的发展，使肿瘤抑制基因去甲基化、提高血浆细胞因子水平；在巴雷特食管炎患者，黑树莓增加GST-π的组织表达水平，并减少8-异前列腺素（脂质过氧化作用/氧化应激的标志物）。
结论：虽然黑树莓用于癌症抑制的精确剂量、持续时间和最佳输送方式仍有待完全阐明，但是研究的结论证明黑树莓可以抗增殖、抗炎、降低氧化应激水平以及恢复肿瘤抑制状态。结论部分阐述了将来的发展方向。
关键词：癌症预防、黑树莓、口腔、食道、结肠、人类临床试验
1. 前言
近数十年，许多临床试验证据都支持BRB作为高风险人群癌前病变或癌症的抑制剂。首先，越来越多流行病学证据显示，基于植物类食物的饮食可降低癌症风险，尤其是上呼吸消化道癌症。第二，显著的临床前动物实验结果显示，BRB通过靶向增殖、炎症、血管生成和凋亡过程抑制口腔癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌和皮肤癌。第三，从组成成分看，黑树莓富含维他命、矿物质、纤维素、花青素、总酚类物质和其它有癌症抑制能力的生物活性成分。最后，初步研究显示，在食用BRB 1-2h后，血浆中的主要花青素和鞣花酸达到最大浓度，在30min-4h之间，尿液中达到最大浓度，其生物利用度令人担忧，只有不到1%的亲本或前体花青素被吸收。但是最近研究显示，花青素的生物利用度可比得上其它黄酮类亚类，花青素的多种代谢产物可被显著吸收，其半衰期从2小时到96小时。反过来，代谢物也可修饰细胞粘附和炎症信号级联，两个重要的癌症相关过程。
2. 材料与方法
利用Pubmed全面检索2015年12月1日前利用黑树莓临床干预癌症或癌前病变的相关文献。关键词搜索包含黑树莓、癌症、癌变前、癌前病变和临床试验，确保所有研究论文都被包含。BRB的临床研究已经完成了对癌症或癌变前的口腔、食管和结肠的试验，这里将一起做综述。综述涉及的临床试验的详细内容都汇总在每一个研究中。
3. 结果
3.1. BRB凝胶在口腔癌前病变患者中的初步研究
禁止烟草、降低酒精摄入及增加水果和非淀粉类蔬菜的消费可阻止约60%的嘴、咽和喉的癌症。在无吸烟史人群中，高水果消费可显著抵抗头颈癌症。Mallery和其同事设计了两个试验，这两个试验建立在流行病学调查基础上并将临床前研究扩展到口腔初癌患者的临床研究。试验将10% BRB 凝胶施用于口腔初癌患者，为期6周，病变范围从角化过度伴不典型增生到严重发育异常。之前已经详细介绍过凝胶的制备。简言之，凝胶含有10%凝固的干黑树莓粉末，pH值为3.5以稳定花青素分子的花色基元阳离子的生物活性。患者每天施用4次凝胶，每次约0.5g BRB。已有两篇研究详细报道了研究细节和选择标准，受试者年龄都在18岁以上且镜下确认口腔上皮癌前病变，最近未使用烟草类产品。第一和第二个研究分别调查了17例和20例呈口腔初癌的患者，及10例口腔上皮呈组织学正常的患者。在施用前切割一半癌前病变组织或正常上皮，正常组织是从腹侧舌正常组织切割。在施用BRB凝胶 6个月后，患者组织进行再次活检，包括剩余处理部位和初始活检区域。检测终点包括组织学诊断和肿瘤抑制基因位点杂合性缺失（INK4a/ARF, p53和FHIT），这两个检测指标都在口腔初癌中有变化且与鳞状细胞癌进展有关。受试者在施用BRB 6周后显示很好的耐受性，没有患者报告副作用且对照组患者的上皮正常组织仍保持正常。最重要的是，BRB 凝胶的施用导致一部分患者组织退化，杂合性缺失率在统计学上显著降低。而且，在施用BRB的受试者中，41%显示病变等级下降，23%显示组织学分级增加，剩余35%组织学分级无任何变化。
在同样的人群中进行了更深入的研究，有3个额外的病例，将结果扩展到生长因子、促炎和血管生成诱导酶类（VEGF、COX-2、iNOS），基因表达谱和微血管密度（MVD）。结果显示，一部分BRB 凝胶的施用可抑制与RNA加工、生长因子再循环和凋亡抑制有关的基因。此外，施用BRB后，COX-2水平显著下降。CD34的检测显示63.6%的患者MVD降低；同时，其余的患者MVD水平升高。这些结果都支持以下结论：BRB凝胶对病变组织退化有积极作用，可降低杂合性缺失、炎症性标志物和MVD；与其他患者相比，这部分患者对BRB的响应更强。
3.2. BRB凝胶在口腔初癌患者中的安慰剂对照研究
基于口腔初癌患者施用BRB凝胶 6周后的乐观结果，继续开展了一个扩大的持续3个月的多中心安慰剂对照试验，进一步评价其有效性。40例镜检确诊的口腔初癌患者参与试验，22例患者随机施用10% BRB凝胶，18例患者施用安慰剂凝胶。在口腔癌前病变部位局部施用BRB 凝胶（每次0.5g，每天4次）导致病变大小、杂合性缺失率和组织学分级都显著降低。相反，安慰剂凝胶组的病变大小显著增加，同时组织学分级没有增加，杂合性缺失水平也没有下降。尤其是，70.6%安慰剂组患者的病变大小显著增加；同时，76.2% BRB凝胶组患者的病变大小显著降低。施用BRB的患者中，41%在3个月后病变等级降低。研究进一步显示，对BRB有响应的患者的病变部位BRB代谢和角质形成细胞分化酶类的预处理水平较高，说明患者内在的代谢和分化能力各不相同。作者对病人之间敏感性变化的讨论为预防试验提出了新的挑战。
我们需要再做一些研究以理解基于患者个体的BRB和多酚类组分的吸收、代谢和生物活性。Kay和同事们最近使用13C标记的花青素-3-葡萄糖苷（C-3-葡萄糖），一种主要的BRB花青素，作为检测药代动力学的新方法并通过C-3-葡萄糖的吸收鉴定新的代谢物。令人意外的是，这种有针对性的标记方法显示，根据吸收的13C剂量的总排出量，花青素的最小生物利用度为12.4%。与之前报道的相比，这个水平是相当高的，同时，也证明花青素的生物利用率与其它黄酮类亚类一样有效。这个研究也报道了不同个体间C13示踪物回收的高度多变，个体间大的差异转而影响化合物的命运和患者对干预的敏感性，正如在口腔研究中提到的。对吸收、代谢和排泄的新理解来源于13C标记研究，同时也应考虑研究其它参与的多酚类组分。
此外，像口腔这样非常容易进入的位置为研究可控的直接药剂输送和患者之间敏感性变化的测定提供了一个现成的模型。它实现了按照剂量更精确的传递，易于一天多次操作，较少剂量即达到疗效且受益于局部代谢。临床前研究证明，当BRB直接与目标区域接触时可以发挥最好的疗效，也有唯一的例外，一项单独的在乳腺癌临床前模型中做的体内研究。因此，新标记方法可能用于改善抑制药物的靶向性并增强我们对不同患者敏感性的理解。
3.3. BRB在barrett’s 食管癌患者中的研究
Barrett’s食管癌（BE）是食管腺癌（EAC）中唯一已知前期病变的，一种快速上升的存活率低的癌症。胃和十二指肠内容物的回流称为胃食管反流病（GERD），是BE和EAC的主要风险因素。GERD经常表现为烧心，估计影响超过6000万美国人。此外，肥胖使BE风险增加1.5到2倍，使EAC风险增加2到2.5倍。因此，有大量人群有BE风险并潜在发展为EAC。基于富含水果、蔬菜和纤维素的植物食物饮食与EAC风险降低有关。一个6个月的初步研究评价了基于食物的化学预防方法的长期耐受性，检测了BRB是否调节氧化损伤和其它与GERD和Barrett’s食管进展相关的异常信号级联。详细的研究方法和选择标准之前已有报道。简言之，所有受试者都是18岁以上、在当前和之前2次内镜检查中诊断有Barrett’s食管（≥1cm）的成年人。20例患者参与，每例患者自己作为对照。女性和男性每天分别以32g和45g服用冻干的或冷冻干燥的BRB粉末。这个数量大约等于1.5杯和2杯水果，是基于早期动物模型临床前研究的结果，饮食中含5%和10%的BRB可抑制食管癌。患者用6盎司水混合BRB粉末，每天早晨口服混合物。服用前和服用BRB 12周和26周后检测尿液标志物。具体的检测包括8-异构前列腺素F2α（8-PGF2α）和8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）的尿排泄率，脂质过氧化标志物和氧化DNA损伤。鞣花单宁代谢物、尿石素A-葡萄糖醛酸酯、尿石素A-硫酸酯和二甲基鞣花酸葡糖苷（DMEAG）在尿液中的水平是第一次检测，作为验证的潜在标志物。在食管和胃组织中评价与增殖、分化、解毒和炎症相关的标志物变化。评价食管组织的具体免疫组化标志物包括：Ki-67、CDX2、GST-pi和NF-κB。此外，第二个结果包括组织病理、Barrett’s食管长度、血压、总胆固醇水平和体重指数的变化。
这项研究结果显示，人体对每天32g和45g、连续6个月服用黑树莓粉有很好的耐受性。并且基于摄入记录和返回的包装数量可以判断每天BRB的消费高达96%。与基线相比，BRB处理12和26周后鞣花单宁代谢物、尿石素A-葡萄糖醛酸酯的水平显著升高。在基线，15%患者表达可检测水平的尿石素A-葡萄糖醛酸酯[70ng/mL]；同时，在12周[1287ng/mL]和26周[1723ng/mL]后，85%患者表达水平都提高，说明尿石素A-葡萄糖醛酸酯可以作为附加的验证指标。BRB消费导致尿中尿石素A-硫酸酯和DMEAG水平的升高；但是，这些代谢物受影响的程度和大小都不同。代谢酶类的差异可能是造成患者之间反应多样的原因，但是需要提供进一步研究以更好的理解代谢酶类个体差异所起的作用及与患者个体肠道菌群潜在的相互作用。
BRB服用12周后可降低8-PGF2α的尿排泄，并在26周后达到统计学显著性。这个标志物被认为是可靠的且相对稳定的总氧化应激水平标志物，更具体的说是脂质过氧化的指标。考虑到6个月试验后平均BMIs显著增加，则8-PGF2gr的降低特别有意义。BRB消费不能显著降低8-OHdG的水平，一个DNA损伤标志物且以高度多变著称。在试验期间，10例患者的8-OHdG显示升高，6例患者显示下降。有趣的是，服用BRB患者的总胆固醇水平没有显著下降，尤其是那些基线胆固醇水平大于200mg/dL（p=0.165）的患者。BRB消费后，胆固醇水平从基线的234mg/dL降低到26周后的226mg/dL。后续的结果与其它最近的研究相一致，都指向浆果消费对心血管健康指标的正面作用，即使是代谢综合征患者。Jeong和同事最近报道了给代谢综合征患者服用一种BRB浓缩物12周后能显著降低总胆固醇和细胞因子包括IL-6和TNF-α水平。肥胖是BE和EAC的高风险因素；因此，正面影响风险因素和癌症进展的药物特别有希望。就组织具体变化而言，主要的正面作用就是55.6%患者的BE上皮解毒标志物GST-pi表达增强。由Ki67作为指标的总增殖率没有改变，2例患者的增值率下降，2例患者增值率上升。患者的BE组织病理等级或BE舌头的长度在服用前后没有显著变化。但是，值得注意的是BE部位的长度有一个30%或1cm的改变，这种改变需要患者样本量达到43才能观察到；因此，本研究还需要继续观察BE长度的变化。综上所述，这些结果都证明每天服用32g和45g BRB可正面影响总胆固醇的血浆代谢物并增加尿中鞣花单宁代谢物，降低尿中脂质过氧化标志物，而且组织的解毒标志物GST-pi水平显著升高。其余组织特定标志物的调控可能需要更高剂量、高频率服用次数或可替代的输送方式。
3.4. BRB在结直肠患者中的研究
美国统计的一年49000例患者中，结直肠癌（CRC）在癌症相关的死亡原因中排名第二。在过去20年，筛查和治疗方式的改进使结直肠癌死亡率下降。尽管约一半诊断为CRC的患者将最终死于疾病。因此，仍然需要更有效的结直肠癌的预防措施和治疗选择。据估计50%的结直肠癌能被预防，主要通过运动、保持健康体重、限制红肉和加工肉制品消费和食用基于植物的富含蔬菜、全谷物和水果的饮食。正面临床前试验结果证明食用BRB显著抑制化学诱导的结肠肿瘤形成。由20例结直肠癌患者参与的一项临床试验已经展开。排除和纳入标准之前已有报道。所有用于检测的组织都取自口服BRB（每次20g，每天3次）1到9周后的患者。主要检测与细胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt信号相关的标志物的变化。消费BRB 4周以上的患者呈现阳性结果。具体结果为BRB可改变癌旁正常组织中DNMT1、SFRP2、PAX6a的甲基化和结直肠组织中DNMT1、SFRP2、PAX6a、WIF1的甲基化。BRB不能诱导全基因组甲基化的改变。免疫组化染色结果显示，BRB调控结直肠组织中的β-actin、Ki-67、TUNEL、CD105、DNMT1和正常组织中的CD105、DNMT1。很多研究显示，BRB可显著改变随结肠癌变化的关键分子信号通路上的大量标志物，这是令人鼓舞的，并且这种作用在相当短时间内即发生。口服BRB 4周以上的患者的许多试验结果都是阳性的，证明即使是短期或潜在的间歇性使用癌症抑制药物也可能受益很多。
根据以上结直肠试验的结果进一步研究了BRB诱导调控的细胞因子、血浆和尿液中的代谢物。已有研究报道了患者消费浆果超过10天后GM-CSF和IL-8血浆水平有显著变化，这种变化与结直肠组织中凋亡诱导和增殖抑制有关。这些结果证明BRB可非常迅速的诱导循环标志物的改变（10天），但是组织特定的变化还需要更长时间服用BRB（4周或更长时间）或者更高累积剂量。这些结果与BE的研究结果是一致的。非靶向代谢分析发现了超过400种已注释的代谢物，其中BRB作用后，在尿液和血浆中分别有34和16种代谢物呈显著变化。BRB作用后具体的代谢通路变化包括氨基酸代谢、脂类代谢和外源性物质。BRB多酚类物质被代谢为与增强的氨基酸代谢物有关的多种苯甲酸。而且，4-甲基邻苯二酚硫酸酯水平在尿液和血浆中都升高，并在组织水平促进凋亡。
3.5. BRB在家族性腺瘤性息肉病患者中的研究
家族性腺瘤性息肉病（FAP）是一种遗传性疾病，其特征为结肠息肉病早发并在40岁时发展为结肠和直肠癌。FAP是由于APC基因胚系突变导致的，需要密切关注患者，通过内窥镜监视以早期检测到息肉。一旦监测到息肉，预防癌症唯一有效的方法是结肠切除术。因此，延迟息肉发展可能为预防方案提供选择或补充。非甾体抗炎药（NSAIDS）可使FAP相关息肉退化，但是由于有相关的肠胃道、心脑血管事件，正在研究无毒性替换策略。因此，由14例FAP患者参加的一个小规模研究用于评价BRB对息肉数量、大小和负荷的潜在有益作用。受试者每天服用BRB，为期9个月。臂1包括7例患者，服用麦芽糊精安慰剂粉末，每天3次，并结合2种BRB直肠栓剂（睡前使用，每次0.7g）。臂2包括另7例患者，服用与水混合的冷冻干燥BRB粉末（每次20g，一天3次），加上2种BRB直肠栓剂（睡前使用，每次0.7g）。具体研究细节之前已有报道。简言之，入选标准为：年龄≥18岁，基线内镜检查显示至少5个大于2mm的直肠息肉可诊断为FAP，现阶段或最近2月没有用NSAID。治疗开始前和36周后，每例患者进行可屈性乙状结肠镜检查，记录息肉数量、大小和负荷，负荷定义为所有大于2mm的腺瘤直径的总和。取两个直肠息肉用于生物标志物组织活检，并在36周后计数并切除所有直肠息肉。结果包括细胞增殖标志物Ki-67的免疫组化分析、TUNEL染色检测凋亡、cMyc、DNMT1、p16和DNA甲基化分析。
结合两个试验臂，研究结果显示使用BRB栓剂后肿瘤负荷显著下降；作者认为口服BRB的患者并没有显示更好的效果。有趣的是，与栓剂单独使用（约40%）相比，组合使用（约75%）后息肉负荷的变化幅度似乎更大，那么试验效果用幅度描述是否更好。为评价口服BRB加栓剂的效果是否强于栓剂单独作用，需要样本量大于7。当然，如口腔初癌试验所讨论的，栓剂的优势可能是依据息肉的位置做到局部释放；不管怎样，需要进一步研究以确定对于FAP患者是否口服加直接释放的组合方法更有优势。试验完成后，有3例患者的息肉数量和负荷都增加，其中1例是单独使用栓剂，2例是使用口服加栓剂的组合。对BRB治疗有响应且肿瘤负荷降低的患者还有其它变化：Ki-67检测显示细胞增殖率下降，DNMT1减少，p16水平增加，yet、cMYC和TUNEL表达没有变化。BRB处理导致p16启动子甲基化降低，但是BRB对无响应患者与有响应患者息肉中Wnt通路拮抗剂、SFRP2和WIF1的影响没有差异。此外，检测了有响应患者APC基因的SNPs差异，但没有发现任何不同。
这些鼓舞人心的结果与早期结肠癌患者的研究一致，但是也有特别之处，因为在有响应患者和无响应患者间，Wnt调节器没有差异改变。这项研究也发现有响应患者腺瘤中，调控Wnt通路的miRNA被BRB去甲基化。总之，BRB靶向结肠癌的强阳性数据显示，BRB对遗传性FAP和非-FAP相关结肠癌都有抑制效果。结果也再次证明，FAP患者群中除响应BRB暴露的患者，还有一部分不响应BRB的患者。
4. 讨论/结论
单一食物来源和癌症防护之间相关性的证据很有限。迄今为止，最有力的癌症抑制证据存在于食物组中，尤其是基于植物的富含水果、蔬菜和纤维素的饮食。在提取物方面，许多证据表明提取物越接近模拟整个植物成分，癌症防护的效果越好。为对比BRB和来源于BRB的提取物对食管癌的抑制作用，开展了一项用F344大鼠的临床前体内研究，比较5%冻干黑树莓粉末和来源于BRB的富含花青素的提取物、来源于BRB的乙醇/水溶性组分、来源于BRB的不溶性组分、来源于BRB的正己烷提取物和来源于BRB的糖组分。结果显示，含有相同水平花青素的5%BRB、花青素组分和乙醇提取物抑制NMBA诱导的食管癌的效果是一样的，说明花青素是BRB中抑制癌症的成分。但是，来源于BRB的不溶或残渣组分也接近于抑制剂，这种组分含有极低水平的花青素，说明每类食品的性质都很复杂，许多与癌症抑制有关的食物的特征没有完全分析清楚。
一项对比评价红色和黄色西红柿与相同水平的提取物番茄红素的临床试验结果显示，短期西红柿摄入可诱导血清变化，这些改变有利于调控被处理细胞中癌症相关基因的表达；同时，一些促癌基因表达的上调显示，提纯的番茄红素既有积极作用又有潜在有害作用。因此，尽管技术进步，但是对癌症抑制有响应的水果或食品基质中的主要或唯一的成分的鉴定仍是一大挑战。
尽管如此，不同黑树莓产品的临床前和早期临床研究都显示，黑树莓对目标癌症的抑制是有益的。已完成出版的临床评价BRB的研究显示，BRB对头颈、食管和结肠的癌前病变或癌症有正面作用。BRB在临床评价的正面作用包括：抗细胞增殖；促细胞死亡通路的激活；口腔上皮内瘤样病变组织退化伴随改善的组织学分级和肿瘤抑制基因相关位点LOH的显著降低，RNA加工相关基因的抑制减弱，生长因子再循环，和口腔中COX-2水平的下降；结肠患者中，FAP相关息肉发展的抑制，已知肿瘤抑制基因（Wnt通路拮抗剂和p16）的去甲基化和改善的血浆细胞因子表达谱（GM-CSF, IL-8）；Barrett’s患者中，BRB治疗后，组织水平的GST-pi增加，脂质过氧化/氧化应激减少（尿-8-异构前列腺素水平），胆固醇水平降低。此外，另一些肥胖患者的研究显示，血清细胞因子水平和血脂包括IL-6、TNF-α、胆固醇都有改善。并不是所有研究结果都是一致的，大部分结果显示，受试人群中响应者和非响应者的百分比反应了个体间的异质性和每种癌症或癌前病变的复杂性。此外，黑树莓的输送方式、传送基质、浓度、频率、周期各不相同，得到的结果也多种多样：BRB被加工成冷冻干燥粉末与水混合成悬浮液用于口服（每天37到60g），直肠栓剂直接单独使用（每天1.4g）或与口服组合（每天60g），外用剂（10% w/w）在口腔以生物粘附凝胶形式作用。对FAP或口腔初癌患者的目标区域都可以实现BRB生物活性成分的直接输送。与悬浮冻干粉末的口服给药相比，这种输送方式所用产品较少，直接接触时间增加，利用了本区域的局部代谢。总之，贯穿各研究的共同结论是，BRB以靶向方式发挥抗炎作用，可降低氧化应激，影响代谢，恢复抑瘤活性，导致口腔和结肠病变的退化。
需进一步研究为达到最佳癌症抑制效果所需BRB的精确剂量和周期，但是现有结果显示较低浓度对降低血脂有益，而在组织中发挥作用需要较高浓度。此外，从1周到9个月的试验时间长度证明，4周到3个月或以上的长期试验更有效果。有必要进一步研究以增强BRB癌症抑制机制研究，并提高我们识别适合BRB治疗的患者的能力。将来临床试验中，有一个可靠的连接摄入和效果的标志物是很重要的。BE试验涉及到鞣花单宁代谢物，但是仅有85% BE患者表达此代谢物，说明患者个体间遗传背景或代谢变化差异会导致代谢物利用方法的复杂性和局限性。将来前瞻性试验应考虑一种替代方法，对BRB产品进行食品分级，引入更精确的合规的评价。
BRB和其它多酚类物质生物利用度和代谢的研究已有一定进展，但是有更多工作需要做。Kay和同事利用13C标记方法评价施用500mg 剂量后原花青素-3糖苷在血液、尿液和粪便样本中的吸收、代谢和排泄。这项研究发现了一些新代谢物，有助于理解化合物在体内的代谢。另一些研究利用这些方法评价其它多酚代谢物，不同的基质和长期服用将更有效果。此外，还有一些有趣有效的研究主要关注基于食品的靶向癌症预防药物输送有关的新产品，可能提供可替代方式或输送基质，尤其是对于容易接近的靶标。比如，与坚硬的糖果蜜饯仅保留60%相比，主要由果胶和淀粉组成的黑树莓糕保留了93%的花青素。
总之，BRB人体临床试验证明了口腔、食管和结肠的化学预防效果。不管怎样，进一步研究是必要的且应包括1）其它更易获得的有益健康的浆果单独或与BRB组合的评价；2）整个BRB水果与主要成分和活性代谢物的比较；3）选择BRB输送方式和基质；4）影响BRB代谢和生物利用度的因素；5）BRB对癌症启动细胞或癌干细胞的作用；6）癌症发生阶段的BRB应用；7）BRB是否增强化疗或放疗的效果。
原文链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5008867/pdf/nihms811560.pdf
原文来源：Kresty L A, Mallery S R, Stoner G D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future[J]. Journal of Berry Research, 2016, 6(2):251-261.
本文系福山生物整理翻译，转载须注明来源自福山生物。
点击咨询
400-113-6988