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萝卜硫素增强人体谷胱甘肽并影响人脑代谢物的一项临床研究

发表于:2021-12-14   作者:Thomas W. Sedlak   来源:Molecular Neuropsychiatry   点击量:555

原文:Thomas W. Sedlak, Leslie G. Nucifora,  Koga M , et al. Sulforaphane Augments Glutathione and Influences Brain Metabolites in Human Subjects: A Clinical Pilot Study[J]. Molecular Neuropsychiatry, 2017, 3(4):214-222.
翻译:
萝卜硫素增强人体谷胱甘肽并影响人脑代谢物的一项临床研究
 
摘要
精神分裂症和其他神经精神疾病期待着有与机制相关的干预措施。已有多项研究表明,过量的氧化应激越来越多地被认为参与脑疾病的病理生理过程,且主要抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)也相应减少。关于通过成像技术用于评估大脑中氧化应激相关变化的技术警告,已迫使研究人员探索外周GSH作为氧化应激相关脑变化的可能病理特征。在GSH缺乏的临床前模型中,我们发现了全脑和外周GSH水平之间的相关性。我们发现,在每日口服给药7天后,天然存在的异硫氰酸酯萝卜硫素增加健康受试者血液的GSH水平。同时,我们通过7-T磁共振波谱探讨了萝卜硫素对前扣带皮层,海马和丘脑中脑GSH水平的潜在影响。除了在服用萝卜硫素后大脑谷胱甘肽水平的持续增加外,还观察到血液和丘脑谷胱甘肽在服用萝卜硫素前后的比例呈显著正相关。这项临床试验研究表明,探索外周GSH水平与临床/神经心理测验的关系,以及萝卜硫素对神经精神疾病中功能改变的影响,具有重要的价值。
 
关键词
萝卜硫素;谷胱甘肽;氧化应激
 
1. 引言
氧化应激是多种人类疾病的病理生理学的基础,从心血管综合征和糖尿病到神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病[1-5]。此外,最近的研究表明,氧化应激也在神经精神疾病如精神分裂症(SZ)中发挥作用[6-9]。
谷胱甘肽(GSH)是氧化应激和氧化还原平衡最重要的调节剂之一。这种抗氧化剂三肽以低毫摩尔细胞内水平存在,并被超过20种酶直接利用以发挥其抗氧化和细胞保护作用。GSH参与许多疾病的病理状态已早有报道[10-13]。
研究和治疗脑部疾病的障碍是获得生物标本,这些标本更容易用于外周疾病。因此,许多研究依赖于更容易获得的血液和脑脊髓液样本来表征神经精神疾病的分子基础[14-23]。尽管受试者之间存在差异,但多项研究报道,在外周可获得的组织和液体(如血液)中,精神分裂症中GSH显著降低[6,18,19,24-29]。
然而,与精神分裂症相关的脑中GSH的分子分布尚不清楚。体内磁共振波谱(MRS)是一种用于测量脑代谢物水平的分析技术[30]。MRS的成功应用显示精神分裂症患者的脑谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)水平发生了改变[31-34]。相比之下,GSH的数据不太一致[19,35,36]。3-T MRS检测谷胱甘肽水平的敏感性有限可能是这种不一致的潜在原因,而使用7-T MRS的研究应该改进检测,并产生更一致的结果。因此,目前对基于MRS的GSH指标的解读应持谨慎态度。目前的MRS方法可能不够灵敏,无法检测与病理改变相关的微妙但关键的变化。因此,许多研究人员正在探索外周GSH作为氧化应激相关脑变化的可能标志的潜在效用。
萝卜硫素是一种天然的植物化学物质,富含在十字花科植物的种子和芽,如西兰花。它在创伤性脑和脊髓损伤的临床前模型中显示出前景[37,38]。萝卜硫素通过与细胞抑制因子KEAP1结合并分离的能力激活转录因子Nrf2 [39,40]。因此,萝卜硫素有望促进适当的氧化还原平衡和对氧化应激[41]的保护。由于其存在于消费性食品中,因此萝卜硫素是进一步人类研究的有吸引力的候选者。事实上,它在治疗哮喘、空气污染损伤、良性前列腺增生、紫外线引起的红斑、糖尿病、控制幽门螺杆菌(胃癌的一种致癌物),以及预防多种不同癌症方面都有潜在的应用价值[42-44]。最近的报道表明,使用萝卜硫素可改善诸如自闭症和精神分裂等人类大脑疾病状况[45-47]。尽管如此,仍然难以理解萝卜硫素如何与神经精神病症的发病机制相关联。
我们假设向受试者使用萝卜硫素可以增加血液和脑部GSH水平,并且外周血GSH水平可以反映大脑中的氧化应激和氧化还原相关的生理学和病理生理学。鉴于萝卜硫素可能是一种候选治疗方法,研究萝卜硫素对GSH的影响可能是确定预测有益效果的标志物的第一步。
 
2. 方法
2.1 小鼠模型
本研究中使用具有CD1背景的神经元谷氨酸转运体-1敲除(Eaac1 KO)小鼠[48]和野生型(WT)小鼠,并将其置于受控设施中(23±1℃; 50±5%湿度;光照和黑暗循环分别在上午7点和下午7点开始),可自由获取食物和水。在来自3个月大的雄性小鼠(Eaac1 KO小鼠,n = 4;WT小鼠,n = 5)的全脑中定量GSH水平。 我们利用雄性动物作为啮齿动物GSH酶水平在发情期间波动高达50%[49]。三个月大的动物体内的谷胱甘肽水平不像一岁以上的啮齿动物那样随年龄增长而下降(3个月龄的动物没有年龄依赖性的GSH水平下降)[50]。
 
2.2 西兰花芽提取物(萝卜硫素)
本研究中使用的西兰花芽提取物是一种高度标准化的萝卜硫素配方制剂[51,52]。如前所述[45,53-58],2个西兰花提取物凝胶胶囊中萝卜硫素的标准含量为100μmol,每天2粒,连续7天。100μmol萝卜硫素的剂量和7天的治疗持续时间是根据先前的研究经验确定的,包括一项试验证明在受试者的鼻腔灌洗细胞中诱导抗氧化酶[59]和改善空气污染物的排泄[56]。本萝卜硫素的配方生物利用度为80%[58],口服摄入后1小时达到血浆峰值水平,一级动力学下降,并在尿液中积极排泄(8小时为60%)[58,60]。
 
2.3 人类研究受试者
在美国马里兰州巴尔的摩的约翰霍普金斯精神分裂症中心招募了9名健康志愿者(5名男性和4名女性)。人口统计信息见表1。男性和女性的GSH水平相似[61]。本研究包括年龄较小的受试者(年龄21-26岁,1名受试者年龄56岁)。如果受试者有严重精神疾病的个人或直系亲属病史、近期医院感染史、慢性神经系统疾病、导致意识丧失的创伤性头部损伤或活性物质滥用,则被排除在外。我们将烟草吸烟者排除在本研究之外,因为吸烟是已知的氧化应激诱导因子[62,63]。具有MRI扫描禁忌症的患者,例如依赖于苯二氮卓类药物,禁止性幽闭恐怖症,金属植入物或假肢,起搏器或对受试者构成安全风险的任何医学病症(例如,中耳疾病)也被排除在外。
 
2.4 临床研究设计
受试者完成了两次间隔时间为7天(1周)的随访。受试者每天早晨空腹服用2个西兰花芽提取物凝胶胶囊给(内含100μmol萝卜硫素),为期1周。研究人员通过电话联系受试者,提醒受试者每天服用按时按量西兰花提取物。在第一次给药前和最后一次给药后4小时内收集尿液和血液样本。在第一次给药前和最后一次给药后4小时内进行MRS扫描。受试者完成了服用提取物的日期和时间的日志记录,并记录了他们在研究期间所经历的任何潜在不适或疾病。三名受试者在空腹服用提取物时表示轻度到中度恶心或腹痛。研究设计总结在在线补充图1中(对于所有在线补充材料,请参见
www.karger.com/doi/10.1159/000487639 )。
 
2.5 血液和脑组织中GSH水平的测量(小鼠和人类)
GSH总量(GSH和谷胱甘肽二硫醚的总和[GSSG])采用Tietze方法的改进方法在人血细胞中测定[64]。我们将“总GSH”简称为“GSH”。 我们使用这些方法在多项研究中量化了GSH和氧化应激[18,65,66]。将非单核细胞血细胞重悬于含有200mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸和1mM EDTA(乙二胺四乙酸)的缓冲液中并超声处理。裂解后的细胞悬液在4℃下以10000 g旋转15分钟。通过加入50%v / v新鲜制备的10%偏磷酸将所得上清液脱蛋白,然后在室温下孵育5分钟。然后将脱蛋白质样品以2,000g旋转2分钟,并将上清液储存在-20℃直至测定。通过向100μL经过偏磷酸处理的细胞裂解物中加入5μL新制备的4M三乙醇胺进行动力学测定。然后严格按照制造商的说明使用试剂盒(Cayman Chemical Company; 703002)测量GSH。测量GSH对5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)还原的415nm处吸光度的增加速率反映了总GSH含量。使动力学测定运行20分钟,每隔1分钟收集数据。血浆中总GSH的浓度报告为nmol / mL。使用0至16nmol / mL的标准曲线校准测定。使用2次独立测量的平均值确定每个报告的GSH值。
 
2.6 7-T磁共振光谱(7-T MRS)
使用配备有32通道头部线圈(Nova Medical,Wilmington,MA,USA)的7-T扫描仪(Philips Achieva; Philips,Best,The Netherlands)扫描所有受试者。采用梯度回波序列(FOV = 220×220×180 mm)磁化制备快速采集3D T1加权图像。使用刺激回声采集模式序列(TE / TM / TR = 14/33 / 3,000ms,NEX = 128),从前扣带皮层(ACC; 30×30×30mm),左侧海马(HP; 35×15×15mm)和双侧丘脑(THAL; 20×30×15mm)记录光谱,除了2个受试者,其中光谱仅从ACC记录,体素大小为38×30×30mm(在线补充图2)。
并非所有剩余的受试者都获得了针对所有三个大脑区域的MRS数据。VAPOR(可变功率和优化的弛豫延迟)水抑制用于最小化主要水信号[67]。另外,还从每个体素(NEX = 16)获得没有水抑制的参考扫描。利用LCModel软件包对光谱进行分析[68],并从VeSPA项目中模拟出一个基集[69]。以未抑制的水信号为参照,对代谢物浓度进行归一化。拟合误差采用CRLBs (Cramér-Rao下界)进行评估。代谢物浓度仅在相应的CRLB值低于20%时才纳入进一步的统计分析。
我们研究的目的是确定萝卜硫素治疗后脑GSH水平的变化,可能与血液GSH水平相关; 因此GSH是我们的主要结果指标。 GABA,谷氨酰胺(Gln),Glu和N-乙酰天冬氨酸(NAA)作为次要结果测量。使用配对t检验比较GABA,Gln,Glu,GSH和NAA浓度的治疗前和治疗后测量值之间的差异。
表1. 临床和人口统计学特征

性别,n(%)  
5(56)
4(44)
平均年龄±SD,年 27.8±10.67
种族,n(%)  
白种人 2(22)
美国黑人 3(34)
亚洲人 2(22)
其他 2(22)
教育水平,n(%)  
高学历 5(56)
大学生 4(44)
是否吸烟,n(%)  
吸烟者 0(0)
不吸烟者 9(100)
 

图1. 测量野生型(WT)和Eaac1敲除(+/-)小鼠中血细胞和脑组织中的谷胱甘肽(GSH)水平。a. 与WT同窝小鼠(n = 5)相比,3个月大的雄性Eaac1 +/-小鼠(n = 4)中淋巴细胞中总GSH水平显著降低。b. 与WT同窝小鼠相比,Eaac1 +/-小鼠中全脑中总GSH水平显著降低。c. 各个动物(白色圆圈,WT小鼠; 黑色圆圈,Eaac1 +/-小鼠)中淋巴细胞和脑中总GSH的水平不同。然而,淋巴细胞中总GSH水平与脑中总GSH水平的比例是恒定的。

图2.测量人血细胞中谷胱甘肽(GSH)的水平。在给予萝卜硫素(SFN)1周后,细胞GSH显著增加(双尾,配对t检验:p = 0.02)。
 
2.7 分析与统计       
使用R版本3.3.0 for Windows进行统计分析。使用萝卜硫素前和后血液GSH比值和代谢物比值计算通过MRS测量的血液GSH水平和脑代谢物水平之间的相关关系。血GSH比值采用Shapiro-Wilk正态检验确定为非参数;因此,我们采用Spearman相关系数来确定血GSH与脑MRS数据之间的关系。对于非参数数据,使用Mann-Whitney检验对WT和Eaac1 KO小鼠中淋巴细胞和脑中的总GSH水平进行两组比较。Spearman相关系数用于确定大脑中总GSH水平与小鼠淋巴细胞中GSH水平之间的关系。
Spearman的相关分析和成对的双尾t检验用于确定性别对对血GSH水平中萝卜硫素反应的影响。Wilcoxon秩和检验用于确定种族类别是否是血液中GSH水平的协变量。Pearson相关分析用于确定年龄对血液GSH水平中萝卜硫素反应的影响。为了进行彻底的分析,使用单变量和多变量线性回归模型分别确定种族和年龄以及性别和种族对THAL GSH水平的萝卜硫素响应的影响。应用Shapiro-Wilk测试来确认正态性(参数或非参数)。 使用Benjamini和Hochberg的方法调整p值。 所有数据表示为平均值±标准偏差(SD)和α值p <0.05。
 
3. 结果
3.1 小鼠模型中观察到的外周和脑GSH水平
我们检测了外周GSH水平是否可以反映动物模型中脑GSH水平的病理生理变化。我们最初使用小鼠模型系统,在这些模型所提供的受控遗传和环境条件下,研究血液和大脑中GSH缺乏的影响。由于研究萝卜硫素对GSH水平的影响是我们的主要目标,人体研究通常具有一定程度的遗传和环境变异性,我们希望小鼠模型可以指导我们的人体研究来检查外周脑与脑内GSH水平之间的关系在控制遗传和环境系统下。我们使用Eaac1 KO小鼠,由于其合成不足,大脑中的GSH水平降低[48]。首先,我们重复了先前的研究结果[48],与WT小鼠相比,Eaac1 KO小鼠的脑GSH水平降低(图1a)。我们的研究表明,与WT小鼠相比,Eaac1 KO小鼠的外周循环淋巴细胞大大降低了GSH水平(p = 0.008)(图1b)。重要的是,脑和外周GSH水平在WT和KO小鼠中显著相关(ρ= 0.967; p <0.001)(图1c)。因此,虽然我们需要谨慎地推广这些观察结果,但外周GSH水平的测量可能是脑GSH水平的潜在有用指标。
 
3.2 每日服用萝卜硫素连续7天后,受试者的血液GSH水平升高
服用前和服用后尿液分析证实存在尿萝卜硫素代谢物,证实受试者遵守口服萝卜硫素方案(数据未显示)。在给予萝卜硫素1周后,研究受试者证实了非单核细胞中GSH的显著增加,其包括T细胞,B细胞和NK细胞的混合物(图2)。给予萝卜硫素前GSH水平为9。22 nmol / mL,使用萝卜硫素后为12。2 nmol / mL,增加32%。萝卜硫素对GSH影响与受试者的年龄(r = -0.1936; p = 0.62)和他们的性别(ρ= 0.087; p = 0.825)都没有相关性。也没有发现种族是一个解释变量,正如四组的Wilcoxon秩和检验所证明的那样(p = 0.318)。
 
3.3 通过MRS测量脑代谢物
在这项研究中,我们获得了三个不同脑区(THAL,HP和ACC)中五种代谢物(GSH,GABA,Gln,Glu和NAA)的测量值。我们特别选择了这三个大脑区域,因为它们是精神分裂症 [70-77]中受影响的关键结构和功能连接的基础。我们在本研究中的主要假设是萝卜硫素可能影响这些大脑区域的GSH水平,并可能与外周血中的GSH水平相关。
我们发现HP GSH从1。11±0.34增加到1。38±0.28 mM(p = 0.041;配对,双尾t检验;在线补充图2)。THAL和ACC中GSH水平的变化没有达到显著性。在给予萝卜硫素之前和之后,THAL GSH水平的代表性成对分析显示在在线补充图3中。关于针对本研究的非主要假设量化的其他脑代谢物,THAL中的Gln水平从1。21±0.22增加至1。49±0.26mM(p = 0.017;配对,双尾t检验)。由于样本量有限,在多次比较的事后校正后,增加并不显著,但在考虑受试者数量较少时,结果仍然具有启发性。
通过线性回归分析确定,脑GSH水平的萝卜硫素响应不受年龄,性别或种族的影响。我们对THAL中测量的GSH水平进行了代表性分析,因为该区域产生的结果与萝卜硫素摄入前后血液中GSH水平的生化测量最显著相关。在多元线性回归分析中,对于年龄,性别和种族使用萝卜硫素之前和之后THAL中GSH水平的各自p值分别为0.582,0.900和0.567,并且种族单变量分析中p = 0.406。总的来说,年龄,性别和种族不是与脑GSH水平的萝卜硫素反应相关的协变量。
我们观察到血液中的GSH水平与THAL脑区域中的GSH水平之间显著正相关(ρ= 0.943; p = 0.017; q = 0.051)。为了提高透明度,我们还报告了在三个不同的脑区测量的所有五种代谢物的相关结果(在线表1)。使用萝卜硫素后,血液GSH的增加与THAL中的GABA,Gln,Glu和GSH正相关。虽然这些相关性在多次比较后并不显著,但仍然具有启发性。 功效分析计算表明,n = 50的样本量将产生显著的结果,这将是未来研究的重点。
 
4. 讨论
我们报道,短期使用萝卜硫素足以显著增加受试者的外周GSH水平。我们发现HP中GSH增加,但在评估的大脑区域中没有。外周GSH比值与萝卜硫素处理后THAL中的脑GSH水平具有强烈且显著正相关,与我们的遗传和环境均一的临床前GSH缺乏小鼠模型研究获得的结果一致。
在这项研究中,我们进行了统计分析,以验证年龄、性别和种族不影响参与人群中GSH水平的萝卜硫素反应。虽然据报道GCLC GAG TNR多态性影响欧洲高加索人群中的GSH水平[78],但我们报道特定基因型可能不会影响我们研究人群(包括非裔美国人在内的北美人群)的水平[79]。遗传和/或环境因素可能影响GSH水平的萝卜硫素反应仍然是难以捉摸的。
如已经报道的心血管和脑血管疾病,可能需要更长的治疗持续时间和/或更高的剂量。例如,在涉及患有2型糖尿病的受试者的临床试验中,报告了氧化应激的改善,其中剂量为10g /天(~225μmol)的萝卜硫素,持续时间为4周,每次显著高于目前研究[80]。这可能是因为我们在本研究中仅观察到萝卜硫素处理后大脑代谢物的暗示性变化。然而,我们的短期给药策略耐受性良好,这将进一步促进随后的萝卜硫素方案,以试图将临床生物标志物与患者导向的结果联系起来。
当通过标准生化测定法定量两者时,外周和脑GSH水平在小鼠中相关。尽管如此,至少对于使用萝卜硫素的当前剂量和持续时间而言,目前尚不清楚血清中的萝卜硫素引起的血液中GSH的增加对于大脑意味着什么。在受试者中通过MRS估计脑中的GSH浓度具有局限性或者至少目前需要谨慎[81]。萝卜硫素可能穿过血脑屏障,尽管它的效力和必要的剂量在人类中尚未建立。在大鼠中,外周给药萝卜硫素可诱导大脑中的抗炎HO-1基因,对脑卒中、创伤性脑损伤和苯环利定诱导的运动亢进均有有益作用[37,82,83]。
萝卜硫素干预的结果研究将受益于将临床表型与客观测量的生物标志物联系起来,这些生物标志物可能反映了疾病的病理生理学[47]。例如,在提交的研究中,我们将报告外周GSH水平可能与认知功能相关。因此,我们认为探索外周GSH与临床/神经心理学测量之间可能的相关性以及萝卜硫素对神经精神障碍中改变的功能测量的影响具有重要意义。本研究是后期同类研究的关键起点。
 
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