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黑树莓对人体结直肠癌遗传和表观遗传学生物标志物的调控：I期先导研究
发表于：2019-02-19 作者：admin 来源：本站 点击量：6338
目的：本研究考察了黑树莓对人类结直肠肿瘤发展的生物标志物的影响，包括相关肿瘤抑制基因的甲基化、细胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt通路基因表达。
实验设计：口服黑树莓粉末（每天60g）前后，分别从20名患者毗邻正常组织和结直肠腺瘤组织取样检查，持续9周。对5个肿瘤抑制基因启动子区域的甲基化定量，测量DNA甲基转移酶1（DNMT1）以及与细胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt信号传导相关的基因的蛋白表达。
结果：三种Wnt抑制剂SFRP2、SFRP5、WIF1—— Wnt通路的上游基因，以及进展调节因子PAX6a的甲基化，在接受黑树莓治疗平均4周的病人的正常组织和结直肠肿瘤中得到了黑树莓直接的保护调节作用；但该作用并没有在接受黑树莓治疗1-9周的20个所有病人身上呈现。这与DNMT1的表达降低有关。BRBs以保护方式调节与Wnt通路、增殖、凋亡和血管发生相关的基因的表达。
结论：这些数据提供了BRBs具备使肿瘤抑制基因去甲基化和调节人结直肠肿瘤发展的其它生物标志物的能力的证据。尽管基因的去甲基化不不是在所有接受黑树莓治疗的患者的结肠直肠组织中都能发生，但是具有第二终点的阳性结果表明，对于BRBs预防人类结肠直肠癌的更多的研究是有必要的。
引言
结直肠癌是美国男性和女性中发生率排行第三的癌症。估计在2009年将有49920人死于结直肠癌，大约占癌症患者死亡数的9%。在过去二十年中，男性和女性结直肠癌的死亡率都有所下降，这反映了发病率下降和疾病早期筛查的增加。这种疾病的5年存活率为64％，并且在确诊后10年继续下降至57％。对于诊断时具有远处转移的患者，5年存活率仅为10％。因此，预防结肠直肠癌仍然是一个重要的目标，化学预防是实现这一目标的一种方法。
我们研究已经表明，在36周的试验中，将含2.5％，5％和10％黑树莓粉的合成饮食施用于氧化偶氮甲烷（AOM）处理的Fischer 344（F-344）大鼠导致相对于仅AOM组，肿瘤数量分别平均降低42％、45％、71%（P<0.05）。 我们还发现这些相同组中氧化性DNA加合物，8-羟基-20-脱氧鸟苷（8-OHdG）在尿液中水平显著降低，表明浆果有减少氧化应激的能力。BRBs在大鼠结肠中减少AOM诱导的肿瘤的机制还没有研究。然而，在使用亚硝胺诱导的食管鳞状细胞癌（SCC）的大鼠模型的研究中，发现BRB能减少增殖、炎症和血管生成，并刺激癌前细胞和组织的凋亡和分化，导致肿瘤发展减少。与这些细胞功能相关的基因也得到了BRBs的保护。
哺乳动物细胞中的DNA甲基化由一系列高度相关的DNA甲基转移酶（DNMT1，DNMT3a和DNMT3b）调节，其介导甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至二核苷酸序列CpG中胞嘧啶碱基的5号位。DNMT1在哺乳动物细胞中充当维持DNA甲基转移酶，并且负责在细胞周期的S期间精确地复制基因组DNA甲基化模式。相反，DNA的从头甲基化被认为由具有维持和从头DNA甲基化活性的DNMT3a和DNMT3b酶进行。然而，两组酶显示在体外表现出一定水平的维持和从头甲基化，这表明DNMT的这种分类可能被过度简化。确认DNA甲基化在肿瘤发生中的重要性，研究显示所有3种DNMT在几种肿瘤类型中过度表达，包括结肠和直肠、膀胱和肾的肿瘤。当DNMT1和DNMT3b在结肠癌细胞中被敲除时，肿瘤抑制基因的甲基化或诸如p16基因几乎完全消除，并且基因重新表达。因此，DNMT的抑制可导致沉默基因的去甲基化和再活化。DNMT的肿瘤抑制基因的异常甲基化可能是化学预防的有希望的目标。 DNMT抑制剂目前正在开发作为癌症的潜在治疗剂。
异常Wnt/β-连环蛋白（Wnt）通路发生在约85%的散发性结肠直肠癌中，并且主要归因于Apc基因的突变。最近的研究结果表明Wnt通路在细胞增殖，分化和干细胞维持中的重要作用。由于失调的基因甲基化导致的Wnt信号传导的破坏也是人结肠直肠癌中的常见事件，例如，Wnt负调节因子，分泌的卷曲相关蛋白2和5（SFRP2和SFRP5）、Wnt抑制因子1（WIF1）的频繁甲基化。已在异常隐窝灶（ACF）和原发性结肠癌细胞中检测到SFRP基因启动子区的甲基化。SFRP在结肠癌细胞中的重新表达阻断Wnt信号传导并导致细胞凋亡。重要的是，这些事件发生在结肠癌细胞中表现出β-连接蛋白突变，它是Wnt通路中的下游基因。据报道在结肠癌细胞中p16、CDKN2A—— 一种细胞周期调节因子、PAX6a—— 一种发展调节因子的沉默，与启动子高甲基化相关。与DNA碱基的突变变化不同，肿瘤抑制基因的DNA甲基化模式的潜在可逆性表明这些是预防和/或治疗结肠直肠癌的可行靶标。
这项研究的目的是调查短期BRBs食疗对Wnt抑制剂——SFRP2，SFRP5和WIF1，以及p16和PAX6a的影响，并在人类结肠直肠癌组织中调节DNMT家族酶。浆果对Wnt通路中下游基因的蛋白表达的影响，即β-连接蛋白、E-钙粘蛋白、c-Myc、细胞增殖标志物（Ki-67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD-105）也都是考察对象。我们的研究结果表明，每天口服BRBs持续平均约4周，在人结直肠组织中会产生多表观遗传和细胞生物标志物保护调节。这些效应好像是结肠直肠组织局部吸收浆果中的活性物质而发生的。
材料和方法
临床试验
本实验中评估BRBs对结肠直肠癌发展生物标志物的影响是由俄亥俄州立大学综合癌症中心的机构审查委员会和得克萨斯大学圣安东尼奥分校批准的。在参与试验之前，从所有患者手中获得书面知情同意书。该试验中的大多数患者是被诊断患有结肠直肠癌的人，并且被送到奥约州立大学詹姆斯癌症医院进行手术。因此，为了符合该试验的条件，他们必须同意进行第二次结肠镜检查或乙状结肠镜检查（取决于肿瘤位置）以获得基线结肠直肠肿瘤和相邻的正常组织用于研究。
A：入选标准
试验中的患者有以下情况之一：
i）具有早期结肠直肠癌（原发性或复发性）的病理诊断的患者，其在结肠或直肠中具有原发性损伤，并且被认为是选择性结肠直肠手术的候选者。
ii）诊断为IV期结直肠癌而在肝或腹部具有转移性损害（癌症病变）的患者也是合格的，条件是原发性损伤存在于结肠或直肠中，并且计划手术切除结直肠病变。
iii）由于大小或其他原因（例如接受抗凝治疗），需要进行重复结肠镜检查或乙状结肠镜检查或手术切除而无法通过初始结肠镜或乙状结肠镜切除的具有结肠息肉或腺瘤的病理诊断的患者。
iv）外科医生慎重判断认为结直肠恶性肿瘤高可能性的患者，具有诸如贫血，直肠出血，体重减轻，肠运动习惯变化，结肠直肠肿块的X射线证据等历史记录，这些患者符合要求。
v）如果没有阻塞性病变或阻塞性症状，直肠癌患者在进行放化疗或手术前是合格的。
B：排除标准
从试验中排除的患者具有以下之一：
i）阻塞或出血的临床症状，并考虑立即手术。
ii）直肠癌或阻塞性病变的候选患者，需立即新的辅助性化/放疗治疗或手术。
iii）目前正在接受化疗或放射治疗的患者（自最后一次化疗治疗后大于4周和放射治疗后大于3周）。
iv）服用非甾体抗炎药（NSAIDs）的患者，由于其临床症状不能停药。
v）怀孕或哺乳期患者。
vi）具有不受控的、未补偿的心脏，肺或肝脏疾病，或不受控制的传染病或糖尿病。
黑树莓
从俄亥俄农场购买新鲜冷冻的BRBs（Jewel品种，2004年收获），并冷冻运送到伊利诺斯州莫门斯的范德鲁南农场，如所述进行冷冻干燥。BRBs的营养物分析和包装详见补充方法。
黑莓用量管理
一剂20g冷冻干燥的浆果粉末与约100mL水混合，每天口服3次（总共60g /d）持续1-9周。每天定期服用浆果粉3次，间隔6小时。60克浆果粉每天接近1.3磅新鲜BRB，相当于7％啮齿动物树莓粉饮食。发现BRB粉末在大鼠饮食中以2.5％至10％的浓度提供时，对大鼠结肠具有化学预防作用。
浆果处理前和浆液处理期间的评估
起初，给所有患者进行身体检查，在此期间获得他们的医疗/手术史，并且完成了乳酸脱氢酶（LDH），癌胚抗原（CEA），完全血细胞计数（CBC）和完全代谢组的实验室测试。然后，他们参加了一次24小时的口头食物召回，以便在用浆果粉治疗之前建立富含酚类食物（包括浆果产品）的消费模式。在浆果治疗期间，每周评估患者一次依从性和任何不良事件。在试验期间，要求患者避免使用除黑莓粉之外的浆果类型。
组织和尿液收集
所有入选试验的患者在进入试验前都诊断为结肠直肠癌。 因为用于初始诊断的组织不可用于研究，所以有必要在浆果治疗患者之前获得另外的组织标本。最初，患者签署了同意书，之后他们停止使用NSAIDs。大约5天后，从结直肠癌患者体内取三个活体样本，每一个毗邻于正常组织（距离肿瘤组织小于2nm的位置）和肿瘤组织。将每份活体样本的一半置于10％福尔马林缓冲液中，另一半在液氮中冷冻。患者在采集组织活检后约24小时开始每天服用BRBs粉末，并直到手术去除肿瘤前12-36小时。在手术时，从每个患者体内取出毗邻正常和肿瘤组织的另外3个活体样本，并如预处理活检所述那样放置在缓冲的福尔马林中或冷冻。所有组织标本由医学病理学家W. Frankel博士在组织病理学上分类为正常或肿瘤组织。所有肿瘤均为腺瘤。
在基线水平和浆果处理后收集了治疗前和治疗后的尿液样本（每个约50mL）。 为了确保浆果花色苷的稳定性，将样本加入5％三氟乙酸降低PH至酸性后保存在-80℃。
测量结直肠组织和尿中的浆果花色苷
在补充方法中详述了样品制备和HPLC-MS / MS分析和花青素的定量。
DNA甲基化的分析
A. DNA提取和亚硫酸氢盐转化。相邻的正常和肿瘤组织用于提取基因组DNA，如补充方法中所述。
B. 质量序列。高通量MassARRAY用于定量p16，PAX6a，SFRP2，SFRP5和WIF1的CpG岛的甲基化水平，如补充方法中所详述。
C. 焦磷酸测序。使用LINE-1重复元件亚硫酸氢盐/焦磷酸测序来评估整体的甲基化水平，如补充方法中所详述。
免疫组织化学染色和计算机辅助图像分析
免疫组织化学染色程序和β-连环蛋白，E-钙粘蛋白，c-Myc，Ki-67，TUNEL，p16，CD105或DNMT1的染色定量在补充方法中详述。
统计分析
实验设计：口服黑树莓粉末（每天60g）前后，分别从20名患者毗邻正常组织和结直肠腺瘤组织取样检查，持续9周。对5个肿瘤抑制基因启动子区域的甲基化定量，测量DNA甲基转移酶1（DNMT1）以及与细胞增殖、凋亡、血管生成和Wnt信号传导相关的基因的蛋白表达。
结果：三种Wnt抑制剂SFRP2、SFRP5、WIF1—— Wnt通路的上游基因，以及进展调节因子PAX6a的甲基化，在接受黑树莓治疗平均4周的病人的正常组织和结直肠肿瘤中得到了黑树莓直接的保护调节作用；但该作用并没有在接受黑树莓治疗1-9周的20个所有病人身上呈现。这与DNMT1的表达降低有关。BRBs以保护方式调节与Wnt通路、增殖、凋亡和血管发生相关的基因的表达。
结论：这些数据提供了BRBs具备使肿瘤抑制基因去甲基化和调节人结直肠肿瘤发展的其它生物标志物的能力的证据。尽管基因的去甲基化不不是在所有接受黑树莓治疗的患者的结肠直肠组织中都能发生，但是具有第二终点的阳性结果表明，对于BRBs预防人类结肠直肠癌的更多的研究是有必要的。
引言
结直肠癌是美国男性和女性中发生率排行第三的癌症。估计在2009年将有49920人死于结直肠癌，大约占癌症患者死亡数的9%。在过去二十年中，男性和女性结直肠癌的死亡率都有所下降，这反映了发病率下降和疾病早期筛查的增加。这种疾病的5年存活率为64％，并且在确诊后10年继续下降至57％。对于诊断时具有远处转移的患者，5年存活率仅为10％。因此，预防结肠直肠癌仍然是一个重要的目标，化学预防是实现这一目标的一种方法。
我们研究已经表明，在36周的试验中，将含2.5％，5％和10％黑树莓粉的合成饮食施用于氧化偶氮甲烷（AOM）处理的Fischer 344（F-344）大鼠导致相对于仅AOM组，肿瘤数量分别平均降低42％、45％、71%（P<0.05）。 我们还发现这些相同组中氧化性DNA加合物，8-羟基-20-脱氧鸟苷（8-OHdG）在尿液中水平显著降低，表明浆果有减少氧化应激的能力。BRBs在大鼠结肠中减少AOM诱导的肿瘤的机制还没有研究。然而，在使用亚硝胺诱导的食管鳞状细胞癌（SCC）的大鼠模型的研究中，发现BRB能减少增殖、炎症和血管生成，并刺激癌前细胞和组织的凋亡和分化，导致肿瘤发展减少。与这些细胞功能相关的基因也得到了BRBs的保护。
哺乳动物细胞中的DNA甲基化由一系列高度相关的DNA甲基转移酶（DNMT1，DNMT3a和DNMT3b）调节，其介导甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至二核苷酸序列CpG中胞嘧啶碱基的5号位。DNMT1在哺乳动物细胞中充当维持DNA甲基转移酶，并且负责在细胞周期的S期间精确地复制基因组DNA甲基化模式。相反，DNA的从头甲基化被认为由具有维持和从头DNA甲基化活性的DNMT3a和DNMT3b酶进行。然而，两组酶显示在体外表现出一定水平的维持和从头甲基化，这表明DNMT的这种分类可能被过度简化。确认DNA甲基化在肿瘤发生中的重要性，研究显示所有3种DNMT在几种肿瘤类型中过度表达，包括结肠和直肠、膀胱和肾的肿瘤。当DNMT1和DNMT3b在结肠癌细胞中被敲除时，肿瘤抑制基因的甲基化或诸如p16基因几乎完全消除，并且基因重新表达。因此，DNMT的抑制可导致沉默基因的去甲基化和再活化。DNMT的肿瘤抑制基因的异常甲基化可能是化学预防的有希望的目标。 DNMT抑制剂目前正在开发作为癌症的潜在治疗剂。
异常Wnt/β-连环蛋白（Wnt）通路发生在约85%的散发性结肠直肠癌中，并且主要归因于Apc基因的突变。最近的研究结果表明Wnt通路在细胞增殖，分化和干细胞维持中的重要作用。由于失调的基因甲基化导致的Wnt信号传导的破坏也是人结肠直肠癌中的常见事件，例如，Wnt负调节因子，分泌的卷曲相关蛋白2和5（SFRP2和SFRP5）、Wnt抑制因子1（WIF1）的频繁甲基化。已在异常隐窝灶（ACF）和原发性结肠癌细胞中检测到SFRP基因启动子区的甲基化。SFRP在结肠癌细胞中的重新表达阻断Wnt信号传导并导致细胞凋亡。重要的是，这些事件发生在结肠癌细胞中表现出β-连接蛋白突变，它是Wnt通路中的下游基因。据报道在结肠癌细胞中p16、CDKN2A—— 一种细胞周期调节因子、PAX6a—— 一种发展调节因子的沉默，与启动子高甲基化相关。与DNA碱基的突变变化不同，肿瘤抑制基因的DNA甲基化模式的潜在可逆性表明这些是预防和/或治疗结肠直肠癌的可行靶标。
这项研究的目的是调查短期BRBs食疗对Wnt抑制剂——SFRP2，SFRP5和WIF1，以及p16和PAX6a的影响，并在人类结肠直肠癌组织中调节DNMT家族酶。浆果对Wnt通路中下游基因的蛋白表达的影响，即β-连接蛋白、E-钙粘蛋白、c-Myc、细胞增殖标志物（Ki-67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD-105）也都是考察对象。我们的研究结果表明，每天口服BRBs持续平均约4周，在人结直肠组织中会产生多表观遗传和细胞生物标志物保护调节。这些效应好像是结肠直肠组织局部吸收浆果中的活性物质而发生的。
材料和方法
临床试验
本实验中评估BRBs对结肠直肠癌发展生物标志物的影响是由俄亥俄州立大学综合癌症中心的机构审查委员会和得克萨斯大学圣安东尼奥分校批准的。在参与试验之前，从所有患者手中获得书面知情同意书。该试验中的大多数患者是被诊断患有结肠直肠癌的人，并且被送到奥约州立大学詹姆斯癌症医院进行手术。因此，为了符合该试验的条件，他们必须同意进行第二次结肠镜检查或乙状结肠镜检查（取决于肿瘤位置）以获得基线结肠直肠肿瘤和相邻的正常组织用于研究。
A：入选标准
试验中的患者有以下情况之一：
i）具有早期结肠直肠癌（原发性或复发性）的病理诊断的患者，其在结肠或直肠中具有原发性损伤，并且被认为是选择性结肠直肠手术的候选者。
ii）诊断为IV期结直肠癌而在肝或腹部具有转移性损害（癌症病变）的患者也是合格的，条件是原发性损伤存在于结肠或直肠中，并且计划手术切除结直肠病变。
iii）由于大小或其他原因（例如接受抗凝治疗），需要进行重复结肠镜检查或乙状结肠镜检查或手术切除而无法通过初始结肠镜或乙状结肠镜切除的具有结肠息肉或腺瘤的病理诊断的患者。
iv）外科医生慎重判断认为结直肠恶性肿瘤高可能性的患者，具有诸如贫血，直肠出血，体重减轻，肠运动习惯变化，结肠直肠肿块的X射线证据等历史记录，这些患者符合要求。
v）如果没有阻塞性病变或阻塞性症状，直肠癌患者在进行放化疗或手术前是合格的。
B：排除标准
从试验中排除的患者具有以下之一：
i）阻塞或出血的临床症状，并考虑立即手术。
ii）直肠癌或阻塞性病变的候选患者，需立即新的辅助性化/放疗治疗或手术。
iii）目前正在接受化疗或放射治疗的患者（自最后一次化疗治疗后大于4周和放射治疗后大于3周）。
iv）服用非甾体抗炎药（NSAIDs）的患者，由于其临床症状不能停药。
v）怀孕或哺乳期患者。
vi）具有不受控的、未补偿的心脏，肺或肝脏疾病，或不受控制的传染病或糖尿病。
黑树莓
从俄亥俄农场购买新鲜冷冻的BRBs（Jewel品种，2004年收获），并冷冻运送到伊利诺斯州莫门斯的范德鲁南农场，如所述进行冷冻干燥。BRBs的营养物分析和包装详见补充方法。
黑莓用量管理
一剂20g冷冻干燥的浆果粉末与约100mL水混合，每天口服3次（总共60g /d）持续1-9周。每天定期服用浆果粉3次，间隔6小时。60克浆果粉每天接近1.3磅新鲜BRB，相当于7％啮齿动物树莓粉饮食。发现BRB粉末在大鼠饮食中以2.5％至10％的浓度提供时，对大鼠结肠具有化学预防作用。
浆果处理前和浆液处理期间的评估
起初，给所有患者进行身体检查，在此期间获得他们的医疗/手术史，并且完成了乳酸脱氢酶（LDH），癌胚抗原（CEA），完全血细胞计数（CBC）和完全代谢组的实验室测试。然后，他们参加了一次24小时的口头食物召回，以便在用浆果粉治疗之前建立富含酚类食物（包括浆果产品）的消费模式。在浆果治疗期间，每周评估患者一次依从性和任何不良事件。在试验期间，要求患者避免使用除黑莓粉之外的浆果类型。
组织和尿液收集
所有入选试验的患者在进入试验前都诊断为结肠直肠癌。 因为用于初始诊断的组织不可用于研究，所以有必要在浆果治疗患者之前获得另外的组织标本。最初，患者签署了同意书，之后他们停止使用NSAIDs。大约5天后，从结直肠癌患者体内取三个活体样本，每一个毗邻于正常组织（距离肿瘤组织小于2nm的位置）和肿瘤组织。将每份活体样本的一半置于10％福尔马林缓冲液中，另一半在液氮中冷冻。患者在采集组织活检后约24小时开始每天服用BRBs粉末，并直到手术去除肿瘤前12-36小时。在手术时，从每个患者体内取出毗邻正常和肿瘤组织的另外3个活体样本，并如预处理活检所述那样放置在缓冲的福尔马林中或冷冻。所有组织标本由医学病理学家W. Frankel博士在组织病理学上分类为正常或肿瘤组织。所有肿瘤均为腺瘤。
在基线水平和浆果处理后收集了治疗前和治疗后的尿液样本（每个约50mL）。 为了确保浆果花色苷的稳定性，将样本加入5％三氟乙酸降低PH至酸性后保存在-80℃。
测量结直肠组织和尿中的浆果花色苷
在补充方法中详述了样品制备和HPLC-MS / MS分析和花青素的定量。
DNA甲基化的分析
A. DNA提取和亚硫酸氢盐转化。相邻的正常和肿瘤组织用于提取基因组DNA，如补充方法中所述。
B. 质量序列。高通量MassARRAY用于定量p16，PAX6a，SFRP2，SFRP5和WIF1的CpG岛的甲基化水平，如补充方法中所详述。
C. 焦磷酸测序。使用LINE-1重复元件亚硫酸氢盐/焦磷酸测序来评估整体的甲基化水平，如补充方法中所详述。
免疫组织化学染色和计算机辅助图像分析
免疫组织化学染色程序和β-连环蛋白，E-钙粘蛋白，c-Myc，Ki-67，TUNEL，p16，CD105或DNMT1的染色定量在补充方法中详述。
统计分析
通过确定浆果治疗前后和每个相对于基线的变量的百分比改变，来定量甲基化和免疫组织化学染色数据。通过Student’s t-检验比较治疗前后平均值、百分比变化和花青素水平的差异。所有分析均为双侧的，小于0.05的P值被认为是显着的。使用线性回归确定甲基化的百分比改变和DNMT1表达百分比改变、浆果剂量和年龄变化之间的相关性。
结果
患者特征
20名患者参与试验，其特征总结在表1中。17名患者来于俄亥俄州立大学，3名来自圣安东尼奥得克萨斯大学。20例患者中有17例为男性，平均年龄为59岁。6名患者有结肠癌（30％），另14名（70％）患有直肠癌。两名患者有转移性疾病。
浆果治疗和依从性
患者口服树莓粉治疗1~9周。患者对浆果治疗的依从性非常好，基于返回的空袋和自我报告，每个患者都服用了规定日剂量的90%以上。浆果粉末通常耐受性良好，7名患者出现胃肠道的轻度干扰，即腹泻和便秘，在2-3天内消退。在研究期间，BRB治疗不改变患者LDH，CBC，CEA和代谢特征
分析尿液和结直肠组织中花青素
浆果治疗前任何患者的尿液中都不存在花青素，20名患者浆果治疗后尿液中检测到4种花青素（补充表S1）。4种花青素的范围在56.2~1822 pmol/ml之间。20名患者中的18个结直肠组织中也检测到4种花青素，然而，量远低于尿液中的量，范围在1.7~2011.5 fmol/mg 组织。（补充表S1）。毗邻正常组织中花青素含量299.9±754.9 fmol/mg，肿瘤组织55.4±60.8 fmol/mg（平均值±标准偏差）；相邻正常组织中的花青素水平与肿瘤组织中的花青素水平没有显着差异（P = 0.21）。
BRBs对肿瘤抑制基因启动子去甲基化和DNMT1蛋白表达的影响
来自所有20个患者的相邻正常和结肠直肠肿瘤组织的联合甲基化数据的初步分析表明，BRB治疗不同时间段（1~9周;平均=3周）未能对SFRP2、PAX6a、p16、SFRP5和WIF1的启动子甲基化产生显着影响，也未能对结肠直肠肿瘤（腺癌）组织中的LINE-1重复元件产生显著影响（图1）。事实上，观察到的唯一显着效应是在毗邻正常组织中SFRP2和SFRP5启动子甲基化减少。从图1显而易见的是，浆果治疗对毗邻正常和肿瘤组织中的基因的启动子甲基化的影响从一个患者到另一个患者是非常不同的。
然而，当患者基于下述方式分组时，观察到了这些基因启动子甲基化的显著差异：（a）摄入的树莓总量，（b）DNMT1蛋白表达的变化程度。来自毗邻正常组织的分析的数据显示在图2中。N/H是指从接受平均83个浆果剂量（~4周的治疗）的患者体内取得的毗邻正常组织。N/L是指从接受平均52个浆果剂量（~2周的治疗）的患者体内取得的毗邻正常组织。图2显示与N/L组织相比，N/H组织中SFRP2和PAX6a肿瘤抑制基因以及DNMT1蛋白表达相对基线，甲基化百分比显着降低。标记为“全部”的框表示，N/H组对比N/L组，所有5种肿瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）组合的甲基化水平降低。
图3显示出了来自接受不同剂量浆果的患者的结肠直肠腺癌的分析数据。T/H是指从接受平均85个浆果剂量（~4周的治疗）的患者体内取得的腺癌。T/L是指从接受平均53个浆果剂量（~2周治疗）的患者体内取得的腺癌。在T/H组肿瘤相对与T/L组肿瘤中，观察到SFRP2，PAX6a和WIF1基因的甲基化变化以及DNMT1蛋白表达对于基线的百分比显着降低。当将来自所有5种抑制基因的启动子甲基化数据组合时，T/H肿瘤数据与T/L肿瘤数据有着显著不同。这些结果表明肿瘤抑制基因的启动子甲基化和DNMT1蛋白表达的变化程度受到摄入的BRB粉末的总剂量的影响。
结果
患者特征
20名患者参与试验，其特征总结在表1中。17名患者来于俄亥俄州立大学，3名来自圣安东尼奥得克萨斯大学。20例患者中有17例为男性，平均年龄为59岁。6名患者有结肠癌（30％），另14名（70％）患有直肠癌。两名患者有转移性疾病。
浆果治疗和依从性
患者口服树莓粉治疗1~9周。患者对浆果治疗的依从性非常好，基于返回的空袋和自我报告，每个患者都服用了规定日剂量的90%以上。浆果粉末通常耐受性良好，7名患者出现胃肠道的轻度干扰，即腹泻和便秘，在2-3天内消退。在研究期间，BRB治疗不改变患者LDH，CBC，CEA和代谢特征
分析尿液和结直肠组织中花青素
浆果治疗前任何患者的尿液中都不存在花青素，20名患者浆果治疗后尿液中检测到4种花青素（补充表S1）。4种花青素的范围在56.2~1822 pmol/ml之间。20名患者中的18个结直肠组织中也检测到4种花青素，然而，量远低于尿液中的量，范围在1.7~2011.5 fmol/mg 组织。（补充表S1）。毗邻正常组织中花青素含量299.9±754.9 fmol/mg，肿瘤组织55.4±60.8 fmol/mg（平均值±标准偏差）；相邻正常组织中的花青素水平与肿瘤组织中的花青素水平没有显着差异（P = 0.21）。
BRBs对肿瘤抑制基因启动子去甲基化和DNMT1蛋白表达的影响
来自所有20个患者的相邻正常和结肠直肠肿瘤组织的联合甲基化数据的初步分析表明，BRB治疗不同时间段（1~9周;平均=3周）未能对SFRP2、PAX6a、p16、SFRP5和WIF1的启动子甲基化产生显着影响，也未能对结肠直肠肿瘤（腺癌）组织中的LINE-1重复元件产生显著影响（图1）。事实上，观察到的唯一显着效应是在毗邻正常组织中SFRP2和SFRP5启动子甲基化减少。从图1显而易见的是，浆果治疗对毗邻正常和肿瘤组织中的基因的启动子甲基化的影响从一个患者到另一个患者是非常不同的。
然而，当患者基于下述方式分组时，观察到了这些基因启动子甲基化的显著差异：（a）摄入的树莓总量，（b）DNMT1蛋白表达的变化程度。来自毗邻正常组织的分析的数据显示在图2中。N/H是指从接受平均83个浆果剂量（~4周的治疗）的患者体内取得的毗邻正常组织。N/L是指从接受平均52个浆果剂量（~2周的治疗）的患者体内取得的毗邻正常组织。图2显示与N/L组织相比，N/H组织中SFRP2和PAX6a肿瘤抑制基因以及DNMT1蛋白表达相对基线，甲基化百分比显着降低。标记为“全部”的框表示，N/H组对比N/L组，所有5种肿瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）组合的甲基化水平降低。
图3显示出了来自接受不同剂量浆果的患者的结肠直肠腺癌的分析数据。T/H是指从接受平均85个浆果剂量（~4周的治疗）的患者体内取得的腺癌。T/L是指从接受平均53个浆果剂量（~2周治疗）的患者体内取得的腺癌。在T/H组肿瘤相对与T/L组肿瘤中，观察到SFRP2，PAX6a和WIF1基因的甲基化变化以及DNMT1蛋白表达对于基线的百分比显着降低。当将来自所有5种抑制基因的启动子甲基化数据组合时，T/H肿瘤数据与T/L肿瘤数据有着显著不同。这些结果表明肿瘤抑制基因的启动子甲基化和DNMT1蛋白表达的变化程度受到摄入的BRB粉末的总剂量的影响。
在图2B和3B的热图中，绿色和红色分别描绘了甲基化的减少和增加。当比较这些数字时，如绿色相对量所显示的证据，毗邻的正常结直肠组织通常比结直肠腺癌组织对浆果诱导的启动子去甲基化的相应更有利。此外，DNMT1蛋白表达和启动子甲基化的变化之间存在正相关（图4A，P=0.006，R2=0.181）。一般来说，用BRBs治疗~4周（高剂量），不是~2周（低剂量），能导致毗邻正常和腺瘤组织中启动子甲基化减少，如图4B所示（P=0.035，R2=0.118）。通过LINE-1重复元件亚硫酸氢盐/焦磷酸测序测定的高剂量组和低剂量组并没有引起毗邻正常组织或结直肠肿瘤组织全甲基化水平相对基线的显著变化（图4c）。用高剂量或低剂量浆果（补充图S1A）治疗的患者的年龄没有显着差异，浆果诱导的启动子甲基化变化非年龄依赖（补充图S1B）。
结直肠组织对树莓粉治疗的应答不同
由于口服时暴露于BRBs化合物的情况，结肠组织可能不同于直肠组织，故我们相信毗邻的正常和结肠肿瘤组织对浆果治疗带来的去甲基化的应答效应可能不同于毗邻的正常和直肠肿瘤组织。图4D描绘了高剂量治疗组（N/H）和低剂量治疗组（N/L）在毗邻的正常结直肠组织中的所有5种肿瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）组合中，甲基化水平相对于基线的变化百分比。当比较两个剂量组的毗邻正常组织时，高剂量治疗组相对于低剂量治疗组，仅直肠组织中的甲基化变化是显著不同的（图4D，P = 0.011）。使用肿瘤标本获得相似的结果，T/H治疗组直肠肿瘤的甲基化水平变化与T/L组显著不同（图4E，P <0.0001）。 有趣的是，位于结肠中的T / L组肿瘤对BRB的响应比直肠中的更好。
BRBs对Wnt信号，细胞增殖，凋亡，血管生成和细胞周期调节的作用
使用定量免疫组化测量毗邻正常和结直肠肿瘤组织蛋白的表达：包括同Wnt途径相关的三种蛋白（β-连环蛋白，E-钙粘蛋白，c-Myc）；同细胞增殖（Ki-67）相关的蛋白；同细胞凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）、细胞周期调节（p16）相关的蛋白。这些蛋白质的代表性染色显示在图5A中。来自所有20名患者的BRBs治疗1-9周前后的数据组合表明，浆果保护性调节结直肠肿瘤组织中的β-连环蛋白、Ki-67、TUNEL、CD105和DNMT1，以及毗邻正常组织中的CD105和DNMT1（图5B）。
把这些组织生物标志物的效用作为摄入总剂量的函数来评价BRB时，发现它们也是有效的。在毗邻正常组织中，高剂量（N/H；~4周治疗）与低剂量（N/L；~2周）相比，浆果治疗后导致β-连环蛋白表达的减少、E-钙粘蛋白表达的增加（图6A，P<0.05）。与N/L组相比，在N/H组伴随着Ki-67蛋白表达的降低、TUNEL染色的增加（P <0.05）。在N/H和N/L两组中，CD105降低、p16增加，但组间差异不显著（P> 0.05）。
在结直肠腺癌中，相对于T/L组织，BRBs治疗导致T/H组织中β-catenin、Ki-67和CD105蛋白的表达百分比相对于基线显着降低，而TUNEL和p16的表达增加（图6B）。同样，这些数据表明对BRB的应答与累积浆果剂量有关。
由于口服时暴露于BRBs化合物的情况，结肠组织可能不同于直肠组织，故我们相信毗邻的正常和结肠肿瘤组织对浆果治疗带来的去甲基化的应答效应可能不同于毗邻的正常和直肠肿瘤组织。图4D描绘了高剂量治疗组（N/H）和低剂量治疗组（N/L）在毗邻的正常结直肠组织中的所有5种肿瘤抑制基因（SFRP2，PAX6a，p16，SFRP5和WIF1）组合中，甲基化水平相对于基线的变化百分比。当比较两个剂量组的毗邻正常组织时，高剂量治疗组相对于低剂量治疗组，仅直肠组织中的甲基化变化是显著不同的（图4D，P = 0.011）。使用肿瘤标本获得相似的结果，T/H治疗组直肠肿瘤的甲基化水平变化与T/L组显著不同（图4E，P <0.0001）。 有趣的是，位于结肠中的T / L组肿瘤对BRB的响应比直肠中的更好。
BRBs对Wnt信号，细胞增殖，凋亡，血管生成和细胞周期调节的作用
使用定量免疫组化测量毗邻正常和结直肠肿瘤组织蛋白的表达：包括同Wnt途径相关的三种蛋白（β-连环蛋白，E-钙粘蛋白，c-Myc）；同细胞增殖（Ki-67）相关的蛋白；同细胞凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）、细胞周期调节（p16）相关的蛋白。这些蛋白质的代表性染色显示在图5A中。来自所有20名患者的BRBs治疗1-9周前后的数据组合表明，浆果保护性调节结直肠肿瘤组织中的β-连环蛋白、Ki-67、TUNEL、CD105和DNMT1，以及毗邻正常组织中的CD105和DNMT1（图5B）。
把这些组织生物标志物的效用作为摄入总剂量的函数来评价BRB时，发现它们也是有效的。在毗邻正常组织中，高剂量（N/H；~4周治疗）与低剂量（N/L；~2周）相比，浆果治疗后导致β-连环蛋白表达的减少、E-钙粘蛋白表达的增加（图6A，P<0.05）。与N/L组相比，在N/H组伴随着Ki-67蛋白表达的降低、TUNEL染色的增加（P <0.05）。在N/H和N/L两组中，CD105降低、p16增加，但组间差异不显著（P> 0.05）。
在结直肠腺癌中，相对于T/L组织，BRBs治疗导致T/H组织中β-catenin、Ki-67和CD105蛋白的表达百分比相对于基线显着降低，而TUNEL和p16的表达增加（图6B）。同样，这些数据表明对BRB的应答与累积浆果剂量有关。
讨论
该研究的结果表明，用BRBs治疗的结肠直肠癌患者后，导致结直肠腺癌和毗邻正常组织中的遗传和表观遗传生物标志物的阳性调节。分析生物标志物如Ki-67，TUNEL，β-catenin，CD105和DNMT1的免疫组织化学数据表明，这些标志物在BRBs治疗后的所有20名患者的组织中被保护性调节。相比之下，DNA甲基化标记物的阳性调节仅发生在用BRB治疗平均4周（高剂量）的患者的组织中，表明浆果治疗必须发生更长的时间段才起效。这些差异的原因可能与以下事实有关：包含多种细胞类型的全组织标本被用于甲基化研究，而免疫组织化学数据主要来自对上皮的分析。因此，如果浆果的影响在上皮中比在其他组织（例如基质）中更明显，则可以预期使用免疫组织化学标记更容易地检测浆果效应。还有可能的是，DNA甲基转移酶如DNMT1的抑制可能仅发生在用浆果长时间治疗后。这些观察表明BRBs在长期的II和III临床试验条件下，可能有效调节肿瘤抑制基因的启动子甲基化，此时可能需要浆果治疗几个月到几年时间。还应指出，虽然我们尽力平等地招募男人和女人参加我们的实验，但我们发现男人更乐意参与。然而，我们将作出更多努力，以减少今后实验中的性别不平衡。
目前的研究结果表明：抛除其它作用机理，BRBs可能具有抑制DNA甲基化的潜力。当以高的日剂量向人口服给药时，BRB引起很小或没有毒性，这使得它非常适合用作化学预防。此外最近研究得出，在家族性腺瘤性息肉病患者当中口服施用BRBs粉末（60g/d，相当于约1.3磅新鲜浆果）9个月，仅在一些患者中产生轻微的胃肠道紊乱，在2 -3天后消除。
该研究的结果表明，用BRBs治疗的结肠直肠癌患者后，导致结直肠腺癌和毗邻正常组织中的遗传和表观遗传生物标志物的阳性调节。分析生物标志物如Ki-67，TUNEL，β-catenin，CD105和DNMT1的免疫组织化学数据表明，这些标志物在BRBs治疗后的所有20名患者的组织中被保护性调节。相比之下，DNA甲基化标记物的阳性调节仅发生在用BRB治疗平均4周（高剂量）的患者的组织中，表明浆果治疗必须发生更长的时间段才起效。这些差异的原因可能与以下事实有关：包含多种细胞类型的全组织标本被用于甲基化研究，而免疫组织化学数据主要来自对上皮的分析。因此，如果浆果的影响在上皮中比在其他组织（例如基质）中更明显，则可以预期使用免疫组织化学标记更容易地检测浆果效应。还有可能的是，DNA甲基转移酶如DNMT1的抑制可能仅发生在用浆果长时间治疗后。这些观察表明BRBs在长期的II和III临床试验条件下，可能有效调节肿瘤抑制基因的启动子甲基化，此时可能需要浆果治疗几个月到几年时间。还应指出，虽然我们尽力平等地招募男人和女人参加我们的实验，但我们发现男人更乐意参与。然而，我们将作出更多努力，以减少今后实验中的性别不平衡。
目前的研究结果表明：抛除其它作用机理，BRBs可能具有抑制DNA甲基化的潜力。当以高的日剂量向人口服给药时，BRB引起很小或没有毒性，这使得它非常适合用作化学预防。此外最近研究得出，在家族性腺瘤性息肉病患者当中口服施用BRBs粉末（60g/d，相当于约1.3磅新鲜浆果）9个月，仅在一些患者中产生轻微的胃肠道紊乱，在2 -3天后消除。
虽然全DNA低甲基化同癌症细胞中导致染色质不稳定的染色质重组和核解体密切关联，但全DNA低甲基化在动物体的影响一直有争议。例如，与动物体肠肿瘤发生的总体抑制相反，低甲基化导致多灶性肝肿瘤的发展。这些结果清楚地证明DNA低甲基化对肠和肝癌产生的相反作用。在人类中，一项研究癌症细胞系全低甲基化，包括乳腺癌，中枢神经系统，结肠，白血病，肝，肺，卵巢和前列腺的研究结果显示，85％的测试细胞系（51/60）都是低甲基化的。有意思的是，当结直肠癌与其毗邻组织比较时，结直肠癌细胞全甲基化是高度可变的，可以增加、不变或降低；在具有微卫星不稳定的癌症中全低甲基化部分逆转，这也许反应了癌症进展有其它路径。因此，全DNA低甲基化在癌症中的概念可能太过简化；致癌作用中全DNA甲基化模式的改变是由于器官和肿瘤类型的特异性。DNA甲基化抑制剂引起启动子和全局重复序列中的低甲基化，因此它们发挥治疗活性。
此外，根据Issa（人名）的研究，尽管肿瘤抑制基因的去甲基化可能具有有益的作用，癌基因的甲基化降低可导致它们的再活化和随后的不良作用。然而，低甲基化剂的治疗效果这可能是基于这样的事实：比起正常成熟细胞，肿瘤细胞更依赖于基因沉默以保持其表型。因此，降低甲基化的总体效果似乎是积极的。此外，甲基化是年龄相关的，并且年龄相关的甲基化似乎是基因和组织特异性的。然而，一些基因（例如p16、SFRP2、与DNA修复相关基因）的甲基化不受年龄的影响；而是它们的甲基化水平随着癌症进展而增加。结直肠癌尤其如此。
在本研究中，BRBs对SFRP2、SFRP5、WIF1、p16和PAX6a基因的启动子甲基化显示不同的影响。例如，尽管BRB降低了N/H相对N/L组中SFRP2和PAX6a基因的甲基化（图2），但是它们对同组中其他3种基因的甲基化没有影响。因此，看来BRBs对不同基因的甲基化的作用表现出一些选择性；但是，数据是初步的，且该作用的机制是未知的。
BRBs对基因去甲基化的影响可能是通过将浆果活性化合物局部吸收到结直肠组织中。这通过在浆果治疗后的结直肠组织中BRB花青素的检测（尽管处于低水平）来证明。基于花青素的花青素的代谢物包括原儿茶酸（细胞培养中的主要降解产物），以及2,4-二羟基苯甲酸和2,4,6-三羟基苯甲酸。该研究报道了50mM的原儿茶酸发挥抗氧化活性，而不是其他两个代谢产物。我们正在确定这些代谢物是否可以在动物和人类的血液中检测到。患者结直肠组织中检出的花色素含量变化巨大（1.7~2011.5 fmol/mg），这可能是由于患者术前（12~36h）最后一次给药是在不同时间。因此，生物标志物数据不能与花青素水平相关。药代动力学研究表明，在口服施用浆果粉末后，BRB花青素分别在1和4小时时在血液和尿液中达到峰值水平。因此，可以预期在手术前长达12-36小时食用浆果的患者结直肠组织中花色素水平的大差异。
致癌作用的“场效应”模型表明，与肿瘤毗邻的细胞至少存在肿瘤本身中存在的一些遗传改变。事实上，毗邻正常组织中的表观遗传改变与人类结肠和乳腺中的癌症进展相关。然而，如图1,2,5和6所示，BRB带来肿瘤抑制基因的去甲基化和相邻“正常”结直肠组织中的细胞增殖和凋亡生物标志物的保护性调节，其可以很好地将这些组织恢复到更高程度的“正常”。
总之，我们的研究结果表明BRBs保护性调节结直肠癌患者组织中基因和表观遗传的生物标志物。浆果似乎对Wnt通路上游肿瘤抑制基因（SFRP2和WIF1）去甲基化，并保护性调节Wnt通路下游的基因（b-连环蛋白，E-钙粘蛋白）的表达。基因去甲基化可能是DNMT1抑制的结果，虽然其他甲基转移酶也可能受到影响。结肠和直肠组织对浆果治疗表现出不同响应；特别是直肠癌患者短期服用BRBs（~2周）已经降低了应答。这表明长期服用浆果治疗结直肠癌患者可能是有益的。它还显示了，如果开发用于将浆果局部递送至直肠组织的方法，则BRB可能在直肠肿瘤患者中更有效。
虽然BRBs对肿瘤抑制基因去甲基化的能力得到数据的支持，初级终点的事实；即20名患者组织去甲基化总体上并不是阳性，意味着需要谨慎解释数据。此外，鉴于甲基化不是结直肠癌化学预防的有效终点，必须谨慎地推断这些结果。虽然我们不推荐浆果用于癌症治疗，当然不能代替标准的治疗方法，但是它们可以被考虑与其它治疗方式（例如化疗，免疫疗，放射疗和/或手术）组合使用。或者，确定在结直肠癌治疗后常规地进行BRBs的饮食消费是否降低复发性疾病的风险将是十分有趣的。
致谢
我们感谢Sara Olivarri帮助患者在德克萨斯大学圣安东尼奥大学进行试验，我们还感谢俄亥俄州立大学的综合癌症中心组织采购共享资源（CCCTPSR）处理这项研究的标本。最后，我们感谢所有患者参与此试验。
原文链接：
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/17/3/598.full-text.pdf
此外，根据Issa（人名）的研究，尽管肿瘤抑制基因的去甲基化可能具有有益的作用，癌基因的甲基化降低可导致它们的再活化和随后的不良作用。然而，低甲基化剂的治疗效果这可能是基于这样的事实：比起正常成熟细胞，肿瘤细胞更依赖于基因沉默以保持其表型。因此，降低甲基化的总体效果似乎是积极的。此外，甲基化是年龄相关的，并且年龄相关的甲基化似乎是基因和组织特异性的。然而，一些基因（例如p16、SFRP2、与DNA修复相关基因）的甲基化不受年龄的影响；而是它们的甲基化水平随着癌症进展而增加。结直肠癌尤其如此。
在本研究中，BRBs对SFRP2、SFRP5、WIF1、p16和PAX6a基因的启动子甲基化显示不同的影响。例如，尽管BRB降低了N/H相对N/L组中SFRP2和PAX6a基因的甲基化（图2），但是它们对同组中其他3种基因的甲基化没有影响。因此，看来BRBs对不同基因的甲基化的作用表现出一些选择性；但是，数据是初步的，且该作用的机制是未知的。
BRBs对基因去甲基化的影响可能是通过将浆果活性化合物局部吸收到结直肠组织中。这通过在浆果治疗后的结直肠组织中BRB花青素的检测（尽管处于低水平）来证明。基于花青素的花青素的代谢物包括原儿茶酸（细胞培养中的主要降解产物），以及2,4-二羟基苯甲酸和2,4,6-三羟基苯甲酸。该研究报道了50mM的原儿茶酸发挥抗氧化活性，而不是其他两个代谢产物。我们正在确定这些代谢物是否可以在动物和人类的血液中检测到。患者结直肠组织中检出的花色素含量变化巨大（1.7~2011.5 fmol/mg），这可能是由于患者术前（12~36h）最后一次给药是在不同时间。因此，生物标志物数据不能与花青素水平相关。药代动力学研究表明，在口服施用浆果粉末后，BRB花青素分别在1和4小时时在血液和尿液中达到峰值水平。因此，可以预期在手术前长达12-36小时食用浆果的患者结直肠组织中花色素水平的大差异。
致癌作用的“场效应”模型表明，与肿瘤毗邻的细胞至少存在肿瘤本身中存在的一些遗传改变。事实上，毗邻正常组织中的表观遗传改变与人类结肠和乳腺中的癌症进展相关。然而，如图1,2,5和6所示，BRB带来肿瘤抑制基因的去甲基化和相邻“正常”结直肠组织中的细胞增殖和凋亡生物标志物的保护性调节，其可以很好地将这些组织恢复到更高程度的“正常”。
总之，我们的研究结果表明BRBs保护性调节结直肠癌患者组织中基因和表观遗传的生物标志物。浆果似乎对Wnt通路上游肿瘤抑制基因（SFRP2和WIF1）去甲基化，并保护性调节Wnt通路下游的基因（b-连环蛋白，E-钙粘蛋白）的表达。基因去甲基化可能是DNMT1抑制的结果，虽然其他甲基转移酶也可能受到影响。结肠和直肠组织对浆果治疗表现出不同响应；特别是直肠癌患者短期服用BRBs（~2周）已经降低了应答。这表明长期服用浆果治疗结直肠癌患者可能是有益的。它还显示了，如果开发用于将浆果局部递送至直肠组织的方法，则BRB可能在直肠肿瘤患者中更有效。
虽然BRBs对肿瘤抑制基因去甲基化的能力得到数据的支持，初级终点的事实；即20名患者组织去甲基化总体上并不是阳性，意味着需要谨慎解释数据。此外，鉴于甲基化不是结直肠癌化学预防的有效终点，必须谨慎地推断这些结果。虽然我们不推荐浆果用于癌症治疗，当然不能代替标准的治疗方法，但是它们可以被考虑与其它治疗方式（例如化疗，免疫疗，放射疗和/或手术）组合使用。或者，确定在结直肠癌治疗后常规地进行BRBs的饮食消费是否降低复发性疾病的风险将是十分有趣的。
致谢
我们感谢Sara Olivarri帮助患者在德克萨斯大学圣安东尼奥大学进行试验，我们还感谢俄亥俄州立大学的综合癌症中心组织采购共享资源（CCCTPSR）处理这项研究的标本。最后，我们感谢所有患者参与此试验。
原文链接：
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/17/3/598.full-text.pdf
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