原文来源：Fahey J W , Stephenson K K , Wade K L ,et al.Urease from Helicobacter pylori is inactivated by sulforaphane and other isothiocyanates[J].Biochemical & Biophysical Research Communications, 2013, 435(1):1-7.DOI:10.1016/j.bbrc.2013.03.126.

萝卜硫素及其他异硫氰酸酯对幽门螺杆菌尿素酶的抑制作用研究

摘要

幽门螺杆菌感染已很普遍，其可引起十二指肠炎症、溃疡，并增加胃癌的风险。源自可食用十字花科植物，如西兰花中的异硫氰酸酯（ITC）萝卜硫素（SF，1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷）对幽门螺杆菌及其耐药性菌种均具有显著的杀菌作用，表明异硫氰酸酯可能是一种有效的食疗方法。幽门螺杆菌感染，具有很高的尿素酶活性，可产生氨，中和胃酸并促进炎症。 SF抑制（灭活）幽门螺杆菌和jack bean菌的尿素酶，这一研究结果的发现，提出了这些特性是否可能在功能上相关的问题。尿素酶活性的失活速率，取决于酶和SF的浓度，并表现出一级动力学特征。纯化的幽门螺杆菌尿素酶经过SF处理后，其在280-340 nm波长处的紫外线吸收会发生变化，且随处理的时间的增长而增加。这一直接的光谱学证据表明，在异硫氰酸酯SF和尿素酶的半胱氨酸硫醇之间形成了二硫代氨基甲酸酯。SF使幽门螺杆菌尿素酶失活的能力令人惊喜。与SF具有相近结构的的天然异硫氰酸酯（berteroin, hirsutin, phenethyl isothiocyanate, alyssin, erucin），虽然它们都有杀菌活性，但并没有使尿素酶失活的作用。此外，SF对尿素酶阳性和阴性的幽门螺杆菌都具有杀菌作用。相反，某些异硫氰酸酯（例如苯甲酰基-异硫氰酸酯）是非常有效的尿素酶灭活剂，但没有杀菌作用。因此，SF和其他异硫氰酸酯对幽门螺杆菌的杀菌作用与尿素酶失活没有必然联系，但它们可以减少幽门螺杆菌感染的炎症成分。

关键词：洋刀豆尿素酶；芥子油苷；二硫代氨基甲酸酯

1. 前言

幽门螺杆菌感染已很普遍，困扰着超过一半的人口，并显着增加了患消化性溃疡，胃恶性肿瘤和淋巴瘤的风险。幽门螺杆菌在不利于其生长胃酸性环境中的成长能力，取决于尿素酶（尿素氨基水解酶； EC 3.5.1.5）的大量产生水平（占总蛋白质的10-15％）。尽管尿素酶在自然界中分布广泛，但这种酶并不存在于哺乳动物组织中。通过从宿主尿素中产生氨，尿素酶可中和胃酸，从而使幽门螺杆菌可以在胃液中增殖。从未从患者中分离到尿素酶缺陷的幽门螺杆菌突变株。值得注意的是，尿素酶可促进粘膜炎症，也可促进其他几种重要的人类致病性感染：结核分枝杆菌，新型隐球菌（与肺部感染有关）和变形杆菌（与尿路感染有关）。

十年前，我们做出了完全出乎意料的实验结果，萝卜硫素[SF; CH3S(O)(CH2)4NCS]是一种异硫氰酸酯，其衍生自同源的芥子油苷（硫代葡萄糖苷），其在西兰花和其他可食用的十字花科植物中含量很高，对幽门螺杆菌具有非常强的杀菌作用。 此外，SF对大量幽门螺杆菌临床分离株非常活跃，其中包括许多对常规抗生素如克拉霉素和甲硝唑具有耐药性的菌株。 这立即提出了一个问题，即饮食上服用SF是否可能是一种在全球范围内对抗幽门螺杆菌感染的实用且经济可行的治疗方法。 幽门螺杆菌的临床病例和小鼠试验显示，萝卜硫素对于幽门螺杆菌感染，尽管不能完全治愈，但能明显减少了定植和炎症。

尽管尿素酶于1926年从洋刀豆中结晶出来，但其分子结构直到最近才被阐明。 来自植物和细菌的尿素酶分子量非常大（1.1百万道尔顿），并且是高度同源的分子，包含12个富含硫醇的催化亚基（每个亚基12个半胱氨酸残基），每个活性位点都有两个镍离子（Ni2 +）。 这些半胱氨酸硫醇的反应性以及可逆抑制剂和不可逆灭活剂对它们的修饰作用已得到广泛研究和报道。许多半胱氨酸残基易受迈克尔反应受体（例如α，β-不饱和酮）抑制的作用。因此，异硫氰酸酯（例如SF）是尿素酶的有效灭活剂也就不足为奇了。

本文分析了SF和相关异硫氰酸酯对幽门螺杆菌尿素酶的抑制作用机理，以及该过程与SF杀菌活性的关系。 由于SF和其他异硫氰酸酯来源于广泛食用的十字花科植物，并且已通过口服给药、临床试验研究表明其耐受性良好，因此希望该类化合物可以作为改善幽门螺杆菌感染的全球策略而进一步得到开发利用。

2. 材料与方法

2.1. 材料

  洋刀豆（Canavalia ensiformis）尿素酶和其他试剂购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）或Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。 活幽门螺杆菌培养物的所有工作均在生物安全2级实验室中进行。

2.2. 细胞培养

在这项研究中使用了五株幽门螺杆菌。 除SS-1（由麻省理工学院的詹姆斯·福克斯博士提供）以外的所有菌株均获自美国典型培养物保藏中心：J99（ATCC 700824），26695（ATCC 700392），60190（ATCC 49503）；美国特有种。 尿素酶阴性变种60190（ATCC 51110），Sydney Strain（SS-1）。 所有幽门螺杆菌培养物均在胰蛋白酶大豆琼脂（Difco）上补充5％的去纤维蛋白羊血（Hemostat Laboratories，Dixon，CA）和Difco Brucella Broth 5％的胎牛血清（Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA）维持。 在BBL Campy Pack Plus系统（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ）的微需氧条件下，将所有幽门螺杆菌培养物保持在37°C下，每盒使用3个除氧小袋，每2-3天更换一次，或在培养箱中 供应10％的二氧化碳。

2.3. 尿素酶活性测试

通过混合25μl/孔的pH 6.8的100 mM磷酸钾缓冲液（含1-4 I.U），在96孔微量滴定板中制备测定混合物。 尿素酶和25μL/孔的潜在抑制剂，并在25°C下孵育指定的时间。 灭活期后，添加酶分析混合物，其中包含200 mL体积的100 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.8，最高达150 mM尿素和0.002％的酚红。 在3分钟内测量570 nm处的吸光度线性变化，并表示为每分钟的毫吸光度单位（mAU / min）。 对于比活测定，将反应速度通过蛋白质浓度实现标准化测定。

2.4. 幽门螺杆菌尿素酶的分离与纯化

尿素酶的提取

用幽门螺杆菌接种一百个10-cm培养皿（见上文），并孵育4天; 将细菌草坪直接刮入pH 7.0的20 mM磷酸钾缓冲液中，并在-80°C冷冻> 8 h。 将冷蒸馏水（1-4°C）添加到冷冻的细胞沉淀中，涡旋解冻，然后离心（5,600×g）10分钟。 除去上清液部分，用5mL冷水再次萃取沉淀，并过滤收集的上清液（0.22μm）。 将滤液（总量约35 mL）离心浓缩（100,000 MWCO Centricon）至11 mL，与甘油混合，以13.2 mL的体积终浓度为20％（v / v），并在以0.5毫升等分试样，-20°C保存。

尿素酶的纯化

通过FPLC和阴离子交换色谱柱，进一步纯化部分幽门螺杆菌尿素酶。使用酚红测定法测定组分中的尿素酶活性，使用双辛可尼酸测定法测量蛋白质含量。合并含有尿素酶活性的组分，通过透析（10,000 MWCO Slide-A-Lyzer cassettes；Thermo Scientific）进行脱盐和浓缩。最后一组合并的馏分集中在10,000 MWCO Amicon“ Ultracell”（Millipore, Billerica, MA）中。通过在SDS PAGE 12％分离凝胶（BioRad，Hercules，CA）上电泳评估组分的纯度。首次FPLC分离使用了Sephacryl S-300 HR 26/60色谱柱（60×2.6 cm，Pharmacia），该凝胶已用凝胶渗透缓冲液平衡过。流速为1 mL / min，洗脱Vo体积后连续收集4-mL馏分。将合并的含尿素酶的组分对离子交换负载的Bis-Tris丙烷缓冲液（120 mM 1,3-双[三[三（羟甲基）-甲基氨基]丙烷）进行透析，并用盐酸调节至pH 6.9。将合并的尿素酶馏分在100K MWCO Amicon Centricon设备中浓缩至最小体积。最终纯化是在MonoQ HR 5/5阴离子交换柱（5×0.5 cm，Pharmacia）上进行的，该柱用相同的缓冲液平衡（流速1 mL / min，使用线性0 – 500 mM NaCl梯度收集的UV峰 18 mL）。合并含有尿素酶的组分，用凝胶渗透缓冲液透析，并浓缩至500μL。

2.5. 尿素酶光谱研究

测量并记录将萝卜硫烷单独添加到幽门螺杆菌尿素酶中引起的光谱变化的时间过程（0-120分钟）。 将部分纯化的幽门螺杆菌尿素酶（3 mg蛋白/ mL）稀释到10 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.2和0.74 mM萝卜硫烷中（LKT Laboratories，St.Paul，MN）; （最终体积为300微升时为9微克）。 使用一对匹配的石英比色皿（4 mm窗口），使用Varian Cary 1E紫外/可见分光光度计（Varian，Walnut Creek，CA）进行光谱测量。

2.6. 最低杀菌浓度测定(MBC)

幽门螺杆菌菌株在含有5％去纤维蛋白羊血的胰蛋白酶大豆琼脂上作为原种培养，并在37°C的微需氧条件下（10％CO2）培养3-4天。 最小杀菌浓度（MBC）的测定在96孔微量滴定板中进行，将测试化合物在含5％（v / v）胎牛血清（每孔最终体积100μL）的胰蛋白酶大豆肉汤中连续稀释。 每个测试孔接种5μL幽门螺杆菌悬浮液，调整至终浓度〜107CFU / mL（A600 nm = 0.12）。 将测定板孵育3天，然后将每个处理孔中的样品在固体培养基上再接种3-4天。 MBC被评定为抑制幽门螺杆菌菌落形成的最低测试化合物浓度。

3. 结果与讨论

3.1. 尿素酶活性测定

NH2 - CO - NH2 + H2O → H2N - COOH + NH3 → H2CO3 + 2 NH3

在含有酚红的弱缓冲（pH 6.8）检测系统中的96孔微量滴定板中测定了尿素酶活性。 产生的NH3对酚红（pKa 8.2）的酚羟基进行电离作用，导致570 nm处的吸收增加。 如最初由Van Slyke＆Archibald所描述的，在最初的3分钟反应期间，这些吸收增加被用作酶活性的测定。 该测定适用于微量滴定板形式。 由于先前尚未证明570 nm处的吸收变化相对于NH3生成和pH呈线性关系，因此我们证实以这种方式确定的反应速度在足够宽的范围内与酶数量呈线性相关关系（图1），以提供简单的方法 进行这些研究的定量分析。

图 1微孔滴定标准曲线，通过改变酚红的吸收率测定氨的含量。 将NH4OH的等分试样添加到200μL的100 mM磷酸钾（pH 6.8）中，该磷酸钾包含0.002％酚红，并测定570 nm（○）和pH（●）的吸收变化。 插图显示了添加越来越多的NaOH后酚红的吸收光谱以及发色团的结构。

在pH 6.8和25°C条件下，通过使用相对于尿素浓度的线性双线性倒数作图，在80 mM磷酸钾缓冲液中，尿素酶的Michaelis 常数为20 mM，对于jack bean尿素酶为20 mM，部分从幽门螺杆菌中提取纯化的尿素酶为4.0 – 6.25 mM。

3.2. 萝卜硫素灭活尿素酶的药代动力学

当尿素浓度在20 – 120 mM时，进行尿素酶活性测量时，通过标准测定方法，将萝卜硫烷或硼酸（一种公认的尿素酶抑制剂）直接添加到幽门螺杆菌尿素酶或jack bean尿素酶中对尿素酶活性没有影响。相反，在不存在尿素的情况下，将这些酶与抑制剂一起培育会导致酶活性下降。尿素酶活性丧失的速率和程度取决于三个因素：抑制剂的浓度，与抑制剂一起培育的持续时间以及酶的浓度。使用SF作为抑制剂，残留酶活性完全不受测定系统中尿素浓度（20 – 120 mM）的影响，一旦这些尿素酶失活，通过增加尿素浓度无法恢复活性（如图2A和2B所示）。在这方面，来自几种幽门螺杆菌（Hp J99，Hp 26695，Hp SS-1和Hp 60190）和jack bean的尿素酶表现相似（如图2C所示）。与之形成鲜明对比的是，尿素酶与硼酸的预先孵育以时间和浓度依赖性的方式，降低了尿素酶的活性，但增加测定系统中尿素的浓度，至少可部分逆转了抑制作用（如图2D所示）。这种行为与SF对幽门螺杆菌的基本不可逆失活相一致，表明酶和抑制剂之间发生了共价反应，并得出结论硼酸至少部分是可逆抑制剂。

图 2通过一系列浓度的萝卜硫素（A，B，C）和硼酸（D）灭活尿素酶。 测定前，将（A）幽门螺杆菌J99菌株和（B）洋刀豆的尿素酶与灭活剂一起孵育1小时。 分析前，将来自（C）4株幽门螺杆菌（60190、26695，SS1，J99）和洋刀豆（JB）的尿素酶与萝卜硫素（SF）孵育2小时。 （D）幽门螺杆菌J99菌株的尿素与硼酸（BA）孵育1小时，然后进行测定。 在120（○），100（△），80（▽），60（◇），40（□）和20（+）mM尿素浓度的存在下测量尿素酶活性。

一系列更详细的研究表明，SF浓度对幽门螺杆菌尿素酶抑制的时间过程是一级反应过程，其速率取决于SF和酶的浓度（图3）。 此外，灭活的拟一级反应速率常数和灭活剂浓度的双倒数图是线性的，这与对另一系统的Kitz和Wilson的分析一致。

图 3 一系列浓度的萝卜硫素（SF）使部分纯化的幽门螺杆菌尿素酶失活的时间过程。 尿素酶浓度分别为26.7μg/ mL（A）和80μg/ mL（B），在20 mM尿素浓度条件下测量剩余的尿素酶活性。 残留活性相对于灭活时间的半对数图是线性的，与一级灭活过程一致。

3.3.萝卜硫素与尿素酶相互作用的光谱分析

与SF通过共价相互作用使尿素酶失活的建议一致，纯化的幽门螺杆菌尿素酶与SF的孵育导致260-320 nm区域紫外线吸收的时间依赖性增加（图4）。 吸收增加的变化幅度取决于SF的浓度。 图4B显示了SF浓度为7.4至740μM的60分钟后在280 nm处观察到的吸收差异。 观察到的吸收变化与SF的异硫氰酸酯（-N = C = S）基团与尿素酶的一个或多个半胱氨酸硫醇基团与在该波长区域吸收更强的二硫代氨基甲酸酯的相互作用相一致。

图 4

（A）用740μM萝卜硫素处理12、30、76和120分钟的部分纯化的幽门螺杆菌尿素酶（9μg/ mL）的差异光谱随时间变化情况。 对照比色杯中含有同等浓度的萝卜硫素。 （B）当将萝卜硫素（7.4 – 740μM）加入部分纯化的幽门螺杆菌尿素酶（30μg/ mL）中时，在60分钟内在280 nm处的吸收变化情况。

尿素酶和尿素酶-SF复合物之间的差异光谱具有两个吸收最大值（在280 nm和320 nm附近）。 后者与二硫代氨基甲酸酯的形成一致。 差异光谱中的两个等吸收点（在250和330 nm附近）表明，这些光谱变化的反应涉及到相对特定的化学反应（如图4A所示）。

3.4. 其他异硫氰酸酯对幽门螺杆菌尿素酶的灭活能力研究

许多SF结构类似物，在浓度为5 mM时，处理幽门螺杆菌尿素酶2小时显示出广泛的抑制（灭活）效果（表1）。 因此，尽管天然产物iberin（甲基亚磺酰基丙基-NCS）与SF的具有相同的抑制作用，但甲基硫戊基-NCS、甲基硫代丁基-NCS、甲基亚磺酰基辛基-NCS和甲基亚磺酰基戊基-NCS均无活性；从辣木树中分离的正己基-NCS、苄基-NCS、苯乙基 -NCS、鼠李糖氧基苄基-NCS也都没有活性。 一个出乎意料的发现是，苯甲酰基-ITC（尚未从天然产物中分离出来）的极高灭活效果，它与经临床测试的尿素酶抑制剂N-（二氨基膦基）-4-氟苯甲酰胺具有实质性的结构相似性。

表1 各种异硫氰酸酯（ITC）使部分纯化的幽门螺杆菌尿素酶失活统计表

（ 底物浓度为20 mM尿素，每次测试均使用80μg尿素酶。）

3.5. 异硫氰酸酯的杀菌活性与尿素酶抑制活力的关系

先前已报道多种针对幽门螺杆菌菌株的SF最低杀菌浓度（MBC），在每毫升低微克范围内。 表2显示了对许多常用的幽门螺杆菌菌株MBC的更详细的研究结果。这些值相对均匀（2.8-5.6μg/ mL），可与我们之前通过不同方法获得的测量值相比较（平均值 2-4微克/毫升）。

表2 萝卜硫素（SF）对几种幽门螺杆菌的最低杀菌浓度（MBC）

非常重要的是，SF对尿素酶阴性且因此无感染力的幽门螺杆菌株（ATCC 51110）具有有效的杀菌作用，而有效的尿素酶抑制剂苯甲酰-ITC对我们测试的几种幽门螺杆菌菌株并没有杀菌活性（数据未显示）。 此外，许多ITC诱导的细胞保护酶诱导剂已被证明对幽门螺杆菌具有杀菌作用[例如5-（甲硫基）戊基-ITC（berteroin）、苄基-ITC 8-（甲基亚硫酰基）辛基-ITC（hirsutin）、苯乙基-ITC、5-（甲基亚磺酰基）戊基-ITC（alyssin）、4-（甲硫基）丁基-ITC（erucin）]， 但它们在与SF、苯甲酰基-ITC和iberin相同的条件下进行测试时，对幽门螺杆菌尿素酶并没有抑制作用（详见表1） 。鞣花单宁和三萜TP-225也有类似的研究结果，它们对幽门螺杆菌具有抗生素活性，但对尿素酶没有抑制作用（数据未显示）。

有趣的是，与培养的哺乳动物细胞中非常高的SF积累形成鲜明对比的是，幽门螺杆菌并未从培养基中明显地浓缩SF（数据未显示）。 显然，由于SF能杀死有害的（尿素酶阴性或阳性）幽门螺杆菌和缺乏功能性尿素酶的突变幽门螺杆菌菌株，所以SF的杀菌/抑菌作用，主要不是取决于尿素酶的是失活。

尿素酶以假定增加紧密连接通透性的方式直接参与与幽门螺杆菌感染相关的炎症，并且与酶的催化活性无关。 ITC抑制这种尿素酶作用模式是否可以改变幽门螺杆菌的致病性而不直接杀死或抑制该生物，需要在适当的模型系统中进行阐明。

总之，尿素酶在生物科学史上发挥了不可预见的作用：（i）尿素酶是第一个被结晶的酶（从洋刀豆中结晶），引起JB Sumner将特定的生物活性归因于纯蛋白质，从而掀起了20世纪最激烈的科学辩论之一； （ii）尿素酶是第一个在活性位点需要两个镍原子的酶； （iii）尿素酶是由除幽门螺杆菌外的几种重要的人类感染因子大量合成的，包括奇异变形杆菌，结核分枝杆菌，新隐球菌，并以重要方式引起这些感染的炎症结果; （iv）已开发出许多用于农业目的的尿素酶抑制剂，以防止土壤因反硝化作用（以及随后的氨蒸发）而消耗氮。本研究提出了一种可能性，增加异硫氰酸酯类化合物的摄入，可能会减少幽门螺杆菌感染和与之相关的炎症。异硫氰酸酯的抑制作用，能否在减少全球一半人口幽门螺杆菌感染中发挥重要作用，值得进一步探索。

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