二甲双胍减缓雄性猴子的衰老时钟（Nrf2通路）
原文来源：Yang Y , Lu X , Liu N ,et al.Metformin decelerates aging clock in male monkeys[J].Cell, 2024, 187(22):6358-6378.e29.DOI:10.1016/j.cell.2024.08.021.
二甲双胍减缓雄性猴子的衰老时钟
图解摘要：长期二甲双胍治疗通过雄性灵长类动物的Nrf2通路降低多维生物年龄并缓解神经元衰老。
亮点：
二甲双胍可预防老年雄性灵长类动物的脑萎缩，并提升其认知功能；
二甲双胍能延缓多种雄性灵长类组织的老化进程；
二甲双胍通过激活Nrf2靶点对雄性灵长类动物的神经元老化起到保护作用。
摘要：在一项历时40个月的严格研究中，我们评估了二甲双胍对成年雄性食蟹猴的抗衰老保护作用，填补了灵长类动物衰老研究领域的空白。该研究通过全面的生理学、影像学、组织学和分子层面评估，证实了二甲双胍在生物体水平上延缓年龄相关表型的作用。具体而言，我们运用全组织转录组学、DNA甲基化组学、血浆蛋白质组学和代谢组学技术，开发出创新的猴类衰老时钟模型，并将其应用于评估二甲双胍的抗衰老效果。研究结果表明，二甲双胍显著延缓了衰老指标，其中大脑衰老进程尤为明显——脑部老化速度约减缓6年。该药物展现出强大的神经保护作用，既能维持脑结构完整性，又能提升认知能力。其对灵长类神经元的抗衰老效果部分通过激活具有抗氧化功能的转录因子Nrf2实现。本研究开创性地通过二甲双胍系统性降低灵长类动物多维度生物年龄，为开发针对人类衰老的药物策略开辟了新路径。
前言
衰老是一个渐进过程，会导致组织功能障碍和生理机能衰退，最终引发神经退行性疾病、心血管疾病及糖尿病等与年龄相关的病症1-5。值得注意的是，越来越多的证据表明，通过小分子药物、基因改造、运动锻炼和饮食干预等手段，啮齿类动物的衰老特征具有可塑性6-11。作为2型糖尿病的一线治疗药物，二甲双胍由Galega officinalis的胍衍生物开发而来，，在线虫、果蝇和啮齿类等多种模型中展现出延缓生理衰老的潜力12-21。包括本研究在内的前期研究也证实，二甲双胍能有效缓解人类二倍体细胞的衰老现象21-25。此外，回顾性研究表明该药物似乎能降低糖尿病患者的死亡率26-28。然而，二甲双胍能否延缓灵长类动物衰老进程并改善其组织退化仍存在争议。
借助高通量组学技术这一前沿工具，我们得以在分子层面精准量化生物衰老速率29。通过整合表观基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据的机器学习方法，为“衰老时钟”研究开辟了新路径，为评估抗衰老干预措施的有效性提供了科学依据30-36。此外，单细胞测序技术的进步深化了我们对衰老过程复杂细胞与分子机制及其干预手段的理解37。然而，二甲双胍在全组织层面促进多维度系统性再生的潜力仍有待深入探索。
为探究二甲双胍是否能延缓与年龄相关的机能衰退，我们开展了一项为期40个月的综合性研究，评估成年灵长类动物服用二甲双胍对衰老的影响。研究采用生理检查、医学影像、全组织组织学分析、全基因组转录组学及单细胞RNA测序（snRNA-seq）等多维度分析技术。通过量化这些参数并整合为“灵长类衰老时钟”模型，我们发现二甲双胍可显著减缓食蟹猴各组织的衰老进程。值得注意的是，研究还揭示了二甲双胍具有显著的神经保护作用，这一结论在人类干细胞源性神经元衰老模型中得到进一步验证。实验结果表明，长期服用二甲双胍能有效延缓灵长类衰老，显示出其在抗衰老管理和疾病预防领域的临床应用潜力。
结果
长期二甲双胍治疗在灵长类动物中表现出衰老保护作用
为评估二甲双胍长期治疗能否延缓健康灵长类动物衰老，我们开展了一项概念验证研究。实验对象为13至16岁的雄性食蟹猴（学名：Macaca fascicularis），相当于人类约40-50岁。研究开始时，按年龄平均分组并随机分配至二甲双胍治疗组或对照组（下文简称O-Met和O-Ctrl）。O-Met组每日给予20毫克/千克二甲双胍（该剂量与人类糖尿病管理标准一致）38,39，同时保持与O-Ctrl组相同的环境和护理条件（图1A）。O-Ctrl组中有一只个体在研究第1126天因肾衰竭死亡，经兽医确认。其余猴子持续接受该方案治疗1200天（约3.3年），相当于人类的10年。
两组受试动物均每3个月进行一次常规体检（图1A）。我们观察到，长期服用二甲双胍并未导致血糖稳态受损，体重也未出现下降（表S1）。同样地，我们也没有发现血细胞组成或尿液生理特征有显著变化（表S1）。
我们还设置了两个额外对照组：分别为3-5岁和10-12岁的年轻成年食蟹猴（Y-Ctrl组）及中年成年食蟹猴（M-Ctrl组）。当O-Met组完成1200天二甲双胍治疗后，我们对四组猴子进行了68项生物参数的全面分析。这些指标包括形态学指标（体重指数BMI、器官指数）、血液检测项目（常规血检、生化检测及激素水平），以及影像学指标（计算机断层扫描[CT]和磁共振成像[MRI]）（图1B）。综合分析结果表明，长期使用二甲双胍具有较高的安全性特征（表S1）。此外，与O-Ctrl组相比，O-Met组的老年相关性牙周骨质流失现象得到显著改善（图1C）。
为评估记忆、学习和认知灵活性，我们采用了Wisconsin通用测试装置（WGTA）方法40,41。在评估记忆保持能力的延迟任务中，O-Met组在延迟后食物提取准确率显著高于O-Ctrl组，表明二甲双胍可能增强老年动物的记忆力（图1D）。此外，在物体辨别任务中，O-Met组展现出更优的学习能力，暗示该药物对改善老年群体的学习表现具有潜力（图1D）。同样，在物体反转学习任务中，O-Met组相比O-Ctrl组表现出更强的认知适应能力（图1D）。
在使用MRI研究脑部形态时，广义线性混合模型（GLMM）显示老年猴子的皮质厚度较年轻个体有所减少，尤其在额叶和颞叶区域（图1E和S1A）。与O-Ctrl组相比，接受二甲双胍治疗的老年猴子额叶皮质厚度得以保持，顶叶皮质则呈现增厚趋势（图1E和S1A）。组织学检查结果一致表明，二甲双胍治疗显著增强了额叶皮质厚度——该区域在猴类中通常会随年龄增长而变薄（图1F）。通过使用CHARM5图谱将大脑划分为88个区域42，我们发现，在二甲双胍治疗的猴子中，有9个区域（主要在额叶）的皮质厚度有所减少（图1G和S1B）。这些脑区包括对认知功能至关重要的皮质区域（图1G和S1B），具体涉及眶额皮层（OFC，即10、11和13号区域）、外侧前额叶皮层（LPFC，即9号区域）、前扣带回皮层（ACC，即24a/b区域）、中扣带回皮层（MCC，即24a/b初级区域）以及运动皮层（即前SMA和SMA）。其中，眶额皮层和外侧前额叶皮层在工作记忆、规则学习和逆向学习中具有重要作用43,44。综合来看，这些发现结合记忆力和认知功能的改善，表明二甲双胍可能延缓与衰老相关的脑部结构退化，尤其在额叶区域表现显著。
二甲双胍可减轻多个组织中与衰老相关的转录波动
为深入解析灵长类衰老机制及二甲双胍干预的系统性效应，我们开展了全生物体和全基因组范围的RNA测序分析。研究对象包括三个不同年龄组（Y-Ctrl、M-Ctrl和O-Ctrl）的食蟹猴，以及接受二甲双胍治疗的老年猴（O-Met），共检测了79个组织器官（涵盖神经系统、皮肤系统、内分泌系统、消化系统、生殖系统、免疫系统、呼吸系统、心血管系统、肌肉系统、泌尿系统和骨骼系统）（图2A和S2A）。通过Mfuzz c均值聚类法进行时间序列分析，揭示出四个特征鲜明的转录动态集群：集群1呈现持续上调趋势（U），集群2显示持续下调趋势（D），集群3先上调后下调（UD），集群4则呈现早期下调后回升的模式（DU）（图2B和S2B）。其中，集群U的基因主要与先天免疫应答和炎症反应相关，而集群D的基因则参与细胞外基质构建和发育过程，这表明随着年龄增长，组织维护与再生能力逐渐衰退（图2B）。
接下来，我们研究了二甲双胍对组织层面年龄依赖性转录组变化的影响。通过对比年轻、中年和老年猴（“Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl”）以及年轻、中年猴和二甲双胍处理的老年猴（“Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Met”）的轨迹变化，发现二甲双胍干预显著缓解了四个集群中与年龄相关的整体转录动态变化。基因集变异分析（GSVA）显示，二甲双胍在U和D集群中显著挽救了基因表达，对其他两个集群的影响较弱（图2C）。为量化二甲双胍延缓衰老的效果，我们计算了组织特异性“救援评分”（详见STAR方法）。值得注意的是，二甲双胍可挽救大部分老化组织（图2D），在11个系统中的79个组织中，额叶、皮肤、肝脏、肾脏、股四头肌和肺等组织获得最高挽救评分（图2D）。通过GSVA在通路水平分析衰老挽救时，我们发现二甲双胍治疗抑制了与衰老相关的炎症反应、细胞凋亡、纤维化和活性氧（ROS）通路（图2E、2F及S2C）。相反，二甲双胍治疗重新激活了通常受衰老抑制的发育和形态发生相关通路，包括Wnt信号传导、脂质代谢和DNA修复通路（图2E和2F）。总之，我们的综合图谱捕捉了组织转录图谱，揭示了二甲双胍在灵长类动物中发挥的整体性衰老保护作用。
二甲双胍可降低各组织中的多种衰老特征
为验证研究结果，我们进行了全面的组织学评估，重点关注衰老的经典特征，特别是那些具有较高恢复评分的组织。初步观察显示，二甲双胍治疗可减少衰老细胞聚集——以肺、肝、肾（包括皮质和髓质）、心脏、胃及皮肤等组织中的p21阳性细胞数量为指标，O-Met组相较于O-Ctrl组呈现显著下降趋势（图3A）。此外，与O-Ctrl组相比，二甲双胍治疗还能有效抑制肺、肾和心脏中与衰老相关的纤维化区域扩张（图3B）。同样，以4-羟基壬烯醛（4-HNE）为标志的泌尿系统中与衰老相关的脂质过氧化积累通过二甲双胍治疗得到缓解（图S3A）。此外，在O-Met猴组织中，二甲双胍对改善与衰老相关的表观遗传不稳定性指标表现出显著效果，例如H3K9me3的缺失和内源性逆转录病毒（ERV）蛋白表达水平的上调（图S3B和S3C）。更值得关注的是，作为骨骼肌衰老关键指标的快肌纤维减少现象，经二甲双胍治疗后得到了有效逆转（图S3D）。
值得注意的是，我们发现二甲双胍在抑制慢性炎症方面具有广泛而显著的作用7,9,45,46。作为衰老的核心标志，慢性炎症是几乎所有与衰老相关疾病的根源。补充二甲双胍可减少肝脏和胃部与衰老相关的炎症区域，并降低肺、肝、肾等器官中的免疫细胞浸润（图3C和3D）。研究还发现，在检测的多种组织中，二甲双胍治疗能有效抑制衰老相关分泌表型（SASP）因子的异常升高，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、S100钙结合蛋白A8（S100A8）以及基质金属蛋白酶9（MMP9）（图3E-3G和S3E）。综上所述，我们的研究结果表明，二甲双胍能有效抑制灵长类动物衰老特征的出现，包括组织退化和炎症反应。
二甲双胍降低多组学生物年龄
为量化二甲双胍诱导的生物年龄减缓效应，我们基于多组学数据建立了猴类衰老时钟的计算模型。除全组织转录组谱分析外，我们还获取了DNA甲基化谱数据，构建了具有最高转录恢复评分的组织DNA甲基化时钟模型。此外，我们通过质谱技术生成定量血浆蛋白质组数据集和代谢组特征（图S4A-S4E）。整合Y-Ctrl、M-Ctrl和O-Ctrl队列（共36只猴子）的数据后，我们成功建立了一个惩罚性线性模型（见STAR方法部分）。该模型可估算每只猴子的生物年龄，并计算ΔAge——即预测生物年龄与该猴子实际生理年龄测量值之间的差异32,47。其中，O-Met组与O-Ctrl组的ΔAge差异被量化为ΔAgeDiff（具体方法参见STAR方法部分）。为此，我们采用弹性网络方法量化了各生物年龄指标：包括基于DNA甲基化的DNAmAge、基于转录组的transcriptAge、基于蛋白质组的proteinAge以及基于代谢组的metabAge，对每只猴子进行评估（图4A；表S3）。
该分析表明，二甲双胍治疗可使实验猴的蛋白质年龄平均恢复6.41年（图4B）。在转录组衰老恢复显著的组织中，DNAmAge也得到了恢复，包括额叶、肺、肾（皮质）、肝和皮肤，它们的平均恢复时间分别为-6.10年、-5.11年、-4.90年、-3.95年和-2.65年（图4C）。基于这些数据，我们进一步研究了二甲双胍对各组织转录组水平生物年龄的影响。分析结果显示，所有十三个组织的转录年龄均被恢复至更年轻状态，具体包括跟腱（ΔAgeDiff -5.31年）、肝脏（ΔAgeDiff -4.14年）、支气管（ΔAgeDiff -3.71年）、肌肉（ΔAgeDiff -3.56年）和肺部（ΔAgeDiff-3.40年）（图4D及表S3）。综合来看，通过生物年龄测量结果可以证实，二甲双胍干预能延缓不同组织和组学层面的衰老进程。
二甲双胍延缓老年猴子肝脏衰老，增强肝保护作用
作为代谢器官，肝脏表现出二甲双胍相关的DNAmAge（ΔAgeDiff约为-3.95年）和transcriptAge（ΔAgeDiff约为-4.14年）的显著降低（图4C和4D）。为了更精确地分析二甲双胍的干预效应，我们对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met组的肝脏样本进行了snRNA-seq（图5A和S5A-S5C）。
随后，我们开发了名为sn-transcriptAge的“单核转录组衰老时钟”，利用覆盖从年轻到中年再到老年阶段的snRNA测序数据，从细胞类型层面表征衰老过程及其减缓机制48。首先，我们通过比较Y-Ctrl、M-Ctrl和O-Ctrl队列中任意两组的差异表达基因（DEGs），截断值为|log2（fold change）| > 0.25，调整后的p值< 0.05，我们将其指定为年龄依赖性DEGs（表S4）。我们以这些衰老差异表达基因的表达矩阵作为输入数据，以每只猴子的实际年龄作为训练标签，采用弹性网络模型构建单细胞衰老时钟。通过留一法交叉验证技术优化模型预测精度（详见STAR方法部分）。将所有细胞类型数据整合为单一输入矩阵后，开发出的综合模型预测二甲双胍治疗可使肝脏平均恢复4.28年（图5B）。值得注意的是，肝细胞、库普弗细胞和T细胞这三种特定细胞类型展现出显著的年轻化修复效果，其sn-transcriptAge指标分别显示出5.83、6.66和6.43年的平均回归值（图5B）。
二甲双胍治疗显著恢复了O-Ctrl组相较于Y-Ctrl和M-Ctrl组持续上调（U簇）或下调（D簇）的基因表达（图S5D和S5E）。总体而言，该药物挽救了约33.9%的U簇差异表达基因和21.2%的D簇差异表达基因（图S5F）。具体而言，不同细胞类型表现出不同的挽救效果，且存在轻微促衰老作用（图S5G）。基因功能注释显示，D簇基因主要参与肝细胞的关键代谢功能，包括脂质转运（如ABCA9、HACL1和SLC22A7）、脂质分解代谢（如HACL1、CYP4F12和PNPLA3），以及氨基酸分解代谢（如ARG1、GNMT和SHMT1）（图S5D）。这些结果表明，二甲双胍治疗可缓解衰老引起的肝脏代谢损伤。相比之下，U簇基因在免疫应答（如LBP、C4BPA和C4BPB）、转化生长因子-β（TGF-β）通路（如SMAD3、TGFBR1和TGFBR3）以及多种细胞类型的炎症反应中富集（图S5D）49,50。值得注意的是，在O-Met猴中抑制U簇基因与炎症和纤维化状态的减轻相关（图S5H）。
在对恢复的差异表达基因（DEGs）比例进行排序时，我们结合Augur评分（一种评估各细胞类型对特定处理敏感性的指标）发现，库普弗细胞、肝细胞和T细胞位列前三，这与我们的生物年龄估算结果一致（图S6A和S6B）。此外，与衰老相关且恢复最显著的批量RNA测序DEGs主要归因于肝细胞的转录变化（图S6C），突显了其在衰老过程及其通过二甲双胍治疗缓解中的关键作用。基因表达轨迹分析显示，二甲双胍治疗后，肝细胞特异性簇U和D基因的表达显著恢复至年轻状态（图S6D）。具体而言，在O-Met组中，与肝细胞衰老相关的通路（如炎症反应信号CRP、LBP和丝氨酸蛋白酶抑制剂SERPINA3，以及脂质代谢相关通路ABCB11、HACL1和SCP2）51-55均恢复到类似Y-Ctrl而非O-Ctrl的状态（图S6E和S6F）。与生物信息学分析结果一致，组织学检测证实载脂蛋白E（APOE）——这种最近被确认为衰老生物标志物的脂蛋白成分56,57——的表达上调已恢复至年轻水平（图S6G和S6H）。通过油红O染色法，我们验证了O-Met组中与年龄相关的异常脂滴聚集现象得到缓解（图S6H）。此外，二甲双胍可降低肝脏中随年龄增长而升高的TNF-α水平和纤维化程度（图S6I和S6J）。综合来看，这些结果表明二甲双胍可能通过增强肝细胞代谢功能来保护肝功能。
二甲双胍延缓大脑衰老，为老年猴子提供神经保护
鉴于二甲双胍治疗后观察到的脑结构和功能改善，且在DNAmAge分析中额叶显示出最显著的修复效果（图4C），我们下一步重点探究了二甲双胍对额叶的抗衰老保护作用。采用与肝脏研究相同的方法，我们对四个猴组的额叶样本进行了snRNA测序（图5C和S7A）。如同在肝脏snRNA测序分析中所做的那样，我们训练了弹性网络模型来全面评估额叶的转录组特征（图5D和5E）。有趣的是，我们发现经二甲双胍处理后的大多数细胞类型都恢复到了更年轻的阶段，其sn-transcriptAge显著降低。通过将所有细胞类型的数据整合到一个统一的模型中，我们能够确定二甲双胍治疗将猴子的额叶平均挽救了5.90年（图5D）。随后，抑制性神经元（InN）（ΔAgeDiff-5.59年）、兴奋性神经元（ExN）（ΔAgeDiff-5.45年）、小胶质细胞（ΔAgeDiff-6.86年）、少突胶质细胞（OL）（ΔAgeDiff-6.79年）、星形胶质细胞（ΔAgeDiff-6.08年）以及少突胶质细胞前体细胞（OPC）（ΔAgeDiff-5.70年）的sn-transcriptAge均呈现显著改善（图5E）。
二甲双胍治疗显著缓解了所有四个集群（U、D、UD和DU）及细胞类型的基因抑制现象，这与生物年龄的逆转效果一致（图S7D和S7E）。在O-Met猴中，对随年龄增长持续增加的U集群衰老差异表达基因（DEGs）进行分析后，其恢复率达30.1%；而D集群随年龄下降的基因则恢复了28.0%（图S7F）。基因本体论（GO术语）分析显示，神经元功能关键基因（如树突形态发生/延伸和突触组装相关基因，例如GSK3B、GRID2和NRG3）在ExN、InN、OL、OPC、小胶质细胞和星形胶质细胞中随年龄增长而下调，但经二甲双胍治疗后得以恢复（图5F）。相比之下，免疫反应激活、补体激活和TGF-β受体信号通路调控等随年龄上调的通路，在二甲双胍治疗下被重新调整至较低水平（图5F）。我们还通过snRNA测序发现，所有细胞类型中促衰老DEGs的数量极少，表明该剂量下的促衰老效应可能可控（图S7G和S7H）。实验验证表明，二甲双胍治疗使与脑衰老及神经退行性疾病进展相关的标志物恢复至接近年轻猴体内的水平。这包括SAb-gal阳性细胞减少、p-Tau（T181）的积累以及促炎因子如MMP9的减少（图5G）。此外，我们观察到，老年猴子特征性的髓鞘厚度减少，在二甲双胍治疗后被重建为年轻状态（图5G）。
接下来，Augur评分评估显示ExN表现出最显著的二甲双胍诱导衰老保护效应（图6A）。鉴于ExN在认知功能中的关键作用，我们对额叶ExN进行了深入分析（图6A-6C）。基因集富集分析（GSEA）表明，二甲双胍治疗恢复了通常随年龄增长而下调的通路，如突触膜粘附、树突形态发生和神经发生（图6B0。此外，与神经元保护相关的基因——这些基因通常随年龄增长而被抑制——在二甲双胍治疗下上调。相反，与神经元衰老和凋亡相关的基因则被二甲双胍下调（图6C）。这些结果进一步得到一系列组织学检测的支持，为二甲双胍的神经保护作用提供了有力证据。具体而言，二甲双胍治疗降低了SPiDER-β-gal阳性神经元的比例，并减轻了核膜完整性受损（图6D和6E）。此外，该药物通过减少聚集斑块和淀粉样蛋白β（Ab）斑块，缓解了神经元内异常蛋白质积累（图6F）。二甲双胍还增强了神经元再生和突触连接，表现为树突伸长——这是神经元结构可塑性和功能能力的关键特征（图6G）。此外，在特别容易受衰老影响的海马体区域，我们观察到小胶质细胞（这种细胞与多种神经退行性疾病及衰老过程密切相关）的聚集现象有所减少，同时神经元核膜完整性也得到恢复（图6H）。值得注意的是，二甲双胍还能增强海马区神经前体细胞的活性（图6H）。这些结果共同表明，通过对抗与年龄相关的细胞变化，二甲双胍能为神经系统提供全面的保护机制，有效抵御衰老带来的负面影响。
二甲双胍以Nrf2依赖的方式自主缓解神经元衰老
我们利用基于人类胚胎干细胞（hESC）衍生神经元的体外模型，评估了二甲双胍的潜在抗衰老保护作用（图S8A-S8C）58,59。通过持续15天给予低剂量二甲双胍（5 mM），我们观察到神经元衰老指标显著改善：β-半乳糖苷酶活性降低、聚集体和淀粉样蛋白沉积减少、白细胞介素-6（IL-6）表达下调，同时核纤层蛋白B2水平恢复（图7A-7C及S8D-S8F）。这些结果表明，二甲双胍可能通过细胞自主机制延缓人类神经元衰老进程。
在评估二甲双胍潜在下游效应因子的蛋白水平时，我们观察到二甲双胍治疗恢复了核因子红系源性2样2（磷酸化Nrf2）的活性形式，这是一种关键的细胞抗氧化反应调节因子，通常在长时间的神经元培养过程中下降（图S8G和S8H）。二甲双胍治疗显著提升了神经元核内磷酸化Nrf2水平，同时上调了HO-1、NQO-1、SOD3、GPX2和GPX1等Nrf2靶基因的表达。这些基因在人类神经元（hNeuron）衰老过程中通常处于抑制状态并呈现下调趋势（图7D、7E、S8I和S8J）。值得注意的是，二甲双胍处理降低了脂质过氧化产物4-HNE的表达及活性氧水平，表明与对照组相比，O-Met组的氧化应激水平明显降低（图7F和S8K）。此外，二甲双胍诱导的hNeuron部分基因表达变化在体内实验中也得到部分验证（图S8L）。经二甲双胍处理后，衰老hNeuron的线粒体基因表达或mtDNA含量未出现显著改变（图S8M-S8P）。这些结果提示，Nrf2活性的增强可能是二甲双胍在灵长类动物神经元中发挥抗衰老保护作用的关键机制。
为验证假设，我们采用两种方法调控hNeuron中的Nrf2活性。首先，通过小干扰RNA（siRNA）敲低Nrf2（图7G、S9A和S9B），即使在二甲双胍存在的情况下，仍能显著降低活性Nrf2及其靶基因的核内水平（图7H、7J、S9C和S9D）。抑制Nrf2会加速神经元衰老进程，而二甲双胍治疗对此无效（图7I和7J）。这些结果表明，二甲双胍的神经保护作用至少部分依赖于Nrf2活性。其次，我们构建了携带E82G突变型Nrf2的人神经元模型，该突变通过阻断KEAP1结合增强Nrf2激活（图7K、S9E和S9F）60,61。这种基因增强策略显著激活了Nrf2通路，表现为核内Nrf2磷酸化水平升高、靶基因表达上调，以及4-HNE和ROS等氧化标志物水平下降——与野生型形成鲜明对比（图7L、7N和S9G-S9I）。因此，长期培养的hNeuron中观察到的细胞衰老表型得到逆转（图7M和7N）。此外，Nrf2持续激活产生的抗衰老效应超越了单独使用二甲双胍的效果，且当与E82G突变共用时，二甲双胍并未增强这些效果（图7M和7N）。这些研究结果与核内磷酸化Nrf2的水平高度吻合，表明Nrf2通路的激活是二甲双胍延缓人类神经元衰老的关键机制。与体外实验结果一致，经二甲双胍处理的猴子在多个组织中也检测到Nrf2通路的激活现象，包括额叶神经元（图7O、7P和S9J）。综上所述，二甲双胍通过激活Nrf2通路，显著延缓了神经元衰老进程，进而延缓大脑衰老。
讨论
在三年多的时间里，我们评估了二甲双胍对健康猴子的全身性衰老保护作用，利用其与人类相似的生理和器官结构，以及它们对疾病和药物的反应58,62-65。我们的研究结果表明，二甲双胍能够改善灵长类动物体内的衰老过程，多维度衰老时钟在治疗后显示出年轻化的趋势。鉴于衰老的复杂性66-69，对抗衰老干预措施进行全面评估至关重要32,70,71。我们的研究揭示了二甲双胍具有组织和细胞特异性的抗衰老保护作用，尤其能显著提升灵长类动物的认知功能。现有证据表明，即使在5 µM浓度下二甲双胍仍可穿越血脑屏障72-77，从而发挥神经保护作用。这些发现提示二甲双胍可能具有延缓大脑衰老的潜力，并有望用于治疗神经退行性疾病及其他慢性病症78-80。
除了糖尿病管理作用外，我们的研究还表明二甲双胍对健康老年猴的血糖影响较小（表S1）。我们证实二甲双胍通过细胞自主通路延缓神经元衰老和脑部老化，其中Nrf2的内在抗氧化机制起着关键作用。与二甲双胍通过AMP激活的蛋白激酶（AMPK）激活和线粒体电子传递抑制而建立的保护机制不同77,82-86，我们的研究结果强调了Nrf2抗氧化途径是一个有希望的衰老保护靶点22,87-90。
值得注意的是，我们在灵长类动物研究中使用的二甲双胍剂量处于标准治疗范围内12,14,91-94，这使得我们的研究成果对人类治疗具有更强的适用性。观察到的衰老生物标志物逆转现象表明，针对器官核心衰老机制进行干预是可行的，为改善慢性疾病和预防与年龄相关的疾病提供了新策略。本研究确定了灵长类动物二甲双胍的最佳给药剂量和时机，阐明了器官特异性敏感性，并提供了药效学见解。此外，我们还引入了用于评估干预效果的预测性生物标志物，包括来自临床活检样本的血浆时钟和组织时钟31,95。这些创新性生物标志物为评估抗衰老干预措施建立了临床标准31,96,97，为系统评估药物对衰老的影响及制定对抗与年龄相关慢性疾病的策略提供了结构化方法。
图1.长期二甲双胍治疗对食蟹猴的行为与影像学评估
(A)食蟹猴长期二甲双胍治疗分析流程示意图。本研究图表中的图形元素源自BioRender.com和Flaticon.com。(B)食蟹猴形态测量分析、医学影像分析及血液分析示意图。(C)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met组食蟹猴牙槽骨微CT检查结果。量化数据以均值±标准误表示，单因素方差分析p值已标注。Y-Ctrl组n = 6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n = 5；O-Met组n = 6。(D)采用威斯康星通用测试装置（WGTA）评估O-Ctrl和O-Met组食蟹猴在延迟任务（上）、辨别任务（中）及反转任务（下）的表现。数据以中位数±标准误呈现。延迟与辨别任务的ANOVA p值已标注，反转任务的曼-惠特尼U检验p值亦一并标注。受试者数量为O-Ctrl组n = 5，O-Met组n = 6。(E)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met组食蟹猴额叶皮质厚度的磁共振成像（MRI）评估结果。以对数2倍变化值表示与O-Ctrl组相比的皮质厚度变化，每个个体猴的皮质厚度数据分别采集自左右半球。各猴子双侧皮层厚度数据以平均值形式呈现。受试者数量统计：Y-Ctrl组6只，M-Ctrl组3只，O-Ctrl组8只，O-Met组6只。数据以中位数±标准误表示，并标注GLMM分析的p值。(F)图示Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl及O-Met猴额叶NeuN蛋白免疫组化评估结果。比例尺为100毫米。Y-Ctrl组6只；M-Ctrl组3只；O-Ctrl组5只；O-Met组6只。量化数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析并附Tukey多重比较检验p值。(G)通过MRI扫描观察Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl及O-Met猴88个脑区。可视化重点显示二甲双胍诱导年轻化治疗后皮层厚度显著变化（p < 0.05）的脑区。受试者数量统计：Y-Ctrl组6只；M-Ctrl组3只；O-Ctrl组8只；O-Met组6只。饼图展示二甲双胍诱导年轻化治疗后各脑叶区域比例分布。详见附图S1及表S1。
图2. 二甲双胍逆转了猴体内多种组织的年龄相关基因表达
(A)示意图展示了11个系统中的79种组织在转录组分析中的变化。(1)皮肤（头皮）；(2)皮肤（前腹侧）；(3)皮肤（后腹侧）；(4)皮肤（内侧腹侧）；(5)皮下脂肪（面部）；(6)皮肤（背侧腹侧）；(7)皮肤（中腹侧）；(8)大脑（枕叶）；(9)大脑（颞叶）；（10）大脑（顶叶）；（11）大脑（枕叶）；（12）大脑（枕叶）；（13）脑干；（14）小脑；（15）大脑（额叶）；（16）大脑（额叶）；（17）大脑（海马体）；（18）背根神经节；（19）脊髓；（20）正中神经（上行）；（21）坐骨神经（下行）；（22）牙龈；（23）舌头；（24）食道；（25）胃；（26）肝脏（右叶）；（27）肝脏（中叶）；（28）肝脏（左叶）；（29）脂肪组织（胰腺）；（30）胰腺；（31）肠道（十二指肠）；（32）肠道（空肠）；（33）肠道（回肠）；（34）脂肪组织（膈肌）；（35）肠道（胸廓）；（36）甲状腺；（37）肾上腺；（38）肾脏（髓质）；（39）肾脏（皮质）；（40）膀胱；（41）外周血单个核细胞（PBMC）；（42）脾脏；（43）精囊；（44）前列腺；（45）阴茎；（46）附睾；（47）睾丸；（48）肌肉（背部）；（49）冈上肌腱；（50）肌肉（肱二头肌）；（51）肌肉（腓肠肌）；（52）跟腱；（53）肌肉（斜方肌）；（54）肌肉（腹部）；（55）肌肉（臀部）；（56）肌肉（股四头肌）；（57）黄韧带；（58）腰椎间盘；（59）心脏（右心房）；（60）心脏（左心房）；（61）心脏（右心室）；（62）主动脉（弓部）；（63）主动脉（胸段）；（64）膈肌；（65）肺（右肺）；（66）肺（左肺）；（67）肺（右肺）；（68）肺（左肺）；（69）气管（上段）；（70）气管（下段）；（71）支气管（上段）（72）支气管（下部）；（73）皮肤（手部）；（74）肺泡组织（颈部）；（75）皮肤（颈部）；（76）肩胛骨肺泡组织；（77）皮肤（背部）；（78）腹腔肺泡组织；（79）皮肤（腹部）。各组织全称详见表S1。(B)猴类组织转录组数据聚类分析，图中显示各簇中年龄相关基因的计数。实线和色带表示各簇标准化FPKM值的平均值±标准差。(C)左图：二甲双胍治疗后猴类年龄相关基因表达变化。实线和色带表示各簇标准化FPKM值的平均值±标准差。右图：箱线图展示不同组别中年龄相关基因的GSVA评分，标注Wilcoxon秩和检验p值。(D)点图展示二甲双胍治疗后各老年组织的恢复评分。初始阶段，使用GSVA算法量化不同组别猴类器官中持续上调和下调的老化基因（簇U和D）的表达量。(E)热图显示基于GSVA评分与衰老相关的恢复通路。(F)箱线图对比特定组织中的选定恢复通路，标注limma软件计算的适度t检验p值。另见图S2和表S2。
图3.二甲双胍缓解猴类组织的多种衰老特征
(A)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、肝、肾、心、胃及皮肤中p21的免疫组化评估。箭头指示p21阳性细胞。肺、肝、肾、心、胃标尺为20毫米；皮肤标尺为10毫米。(B)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、肾、心的马松三色染色评估。标尺为20毫米。(C)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、肝、肾CD45的免疫组化与免疫荧光检测。箭头指示CD45阳性细胞。标尺为20毫米。(D)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肝、胃苏木精-伊红（H&E）染色评估。虚线圆圈和箭头指示炎症区域。标尺为40毫米。(E)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、肠TNF-a的免疫组化与免疫荧光检测。箭头指示TNF-a阳性细胞。标尺为20毫米。(F)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肠IL-1b免疫荧光检测。箭头指示IL-1b阳性细胞。标尺为20毫米。(G)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴肺、心、肝、肾S100A8的免疫组化与免疫荧光检测。箭头指示S100A8阳性细胞。标尺为20毫米。图(A)-(G)中的定量数据以均值±标准误表示，其中(C)图肝脏数据采用Mann-Whitney检验p值，(A)(B)图通过单因素方差分析结合Tukey多重比较检验得出p值，(C)及(D)-(G)图分别对应肺部和肾脏数据。Y-Ctrl组样本量n = 6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n=4-5；O-Met组n=5-6（数据来源见(A)-(G)图）。详见附图S3。
图4.二甲双胍治疗猴类生物衰老的多组学分析
(A)二甲双胍治疗猴类多层次生物年龄评估示意图。(B)左图：基于血浆蛋白质组学预测的生物年龄（蛋白年龄）散点图；右图：二甲双胍对猴类蛋白年龄的恢复效果箱线图。(C)棒状图展示基于DNA甲基化数据的猴类多组织生物年龄（DNA甲基化年龄，DNAmAge）；中图：基于组织DNA甲基化数据的显著（p < 0.05）二甲双胍诱导组织DNAmAge恢复散点图；下图：二甲双胍治疗对猴类DNAmAge恢复效果的箱线图。(D)棒状图展示基于批量RNA测序数据的猴类多组织生物年龄（转录本年龄，transcriptAge）；中图：基于组织批量RNA测序数据的前5个二甲双胍诱导组织恢复散点图；下图：二甲双胍治疗后猴类转录本年龄下降箱线图。图中(C)和(D)所示恢复组织均置于水平线上方，组织点颜色与图2A一致。图B-D中的虚线表示预测生物年龄与猴类实际年龄预期值（DAge = 0）无差异，点距虚线距离代表个体衰老速度。图(B)至(D)中的Wilcoxon秩和检验p值已标注。另请参见图S4和表S3。
图5.二甲双胍缓解猴类肝脏及额叶衰老(A) UMAP图展示猴类不同肝细胞类型的分布（上）。其他UMAP图显示4组间细胞类型分布（下）。(B)径向柱状图展示二甲双胍通过肝snRNA测序数据恢复多种猴肝细胞类型生物年龄（sn-transcriptAge）的效果。散点图呈现肝snRNA测序的sn-transcriptAge数据。箱线图显示二甲双胍对猴sn-transcriptAge的恢复效果。仅绘制显著性（Wilcoxon秩和检验p值< 0.05）的恢复细胞类型，圆点代表测试集或O-Met组中的元细胞。(C) UMAP图显示脑部（FL）不同细胞类型的分布（左）。UMAP图显示4组间不同细胞类型的分布（右）。(D)散点图展示额叶snRNA测序预测的整合生物年龄（sn-transcriptAge）（左）。箱线图显示二甲双胍治疗对猴额叶整合生物年龄的恢复效果。每个圆点代表测试集或O-Met组的元细胞。(E)径向柱状图展示基于额叶snRNA测序的猴额叶多细胞类型生物年龄（sn-transcriptAge）恢复效果（左）。散点图（右上）显示来自额叶snRNA测序的sn-transcriptAge数据。箱线图（右下）展示二甲双胍治疗对猴sn-transcriptAge的恢复效果。通过Wilcoxon秩和检验筛选出的具有统计学意义（p<0.05）的救援细胞类型均被单独绘制。左图中的点状图展示了额叶snRNA测序数据的整合sn转录年龄。箱线图显示了二甲双胍治疗对猴类额叶整合生物年龄的改善效果，每个圆点代表测试组或对照组的元细胞。(F)网络图展示了通过功能富集分析发现的、在不同细胞类型中上调和下调的差异表达基因显著富集的代表性GO术语。(G)对Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴脑衰老的评估包括：SA-b-gal染色、p-Tau（T181）和MMP9免疫荧光检测，以及额叶平均髓鞘厚度的电子显微镜分析。脑部SA-b-gal染色及p-Tau（T181）/MMP9免疫荧光分析的比例尺为20毫米；电子显微镜分析平均髓鞘厚度的比例尺为1毫米。Y-Ctrl组n = 6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n = 5；O-Met组n = 6。量化数据以均值±标准误表示，单因素方差分析结合Tukey多重比较检验的p值已标注。(B)、(D)、(E)图中的虚线表示预测生物年龄与实际年龄预期测量值（DAge = 0）无差异，圆点与虚线间距代表个体衰老速率。另见附图S5、S6、S7及表S4。
图6.二甲双胍在老年猴额叶中展现神经保护特性
(A)Augur软件通过snRNA测序绘制的细胞类型优先级散点图。(B)显示年龄依赖性差异表达基因的散点图。排序依据log2倍数变化（左图：O-Met/O-Ctrl）。红色、蓝色和灰色圆点分别代表上调、下调及未恢复的基因。右侧柱状图展示二甲双胍治疗后猴额叶兴奋性神经元的基因集富集分析（GSEA）结果。(C)四组代表性基因集评分的岭图，黑色线表示中位表达量，标注Wilcoxon秩和检验p值。(D)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴脑额叶SPiDER-b-gal染色评估及NeuN免疫荧光检测。比例尺：20毫米。(E)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴脑额叶Lamin B2与NeuN免疫荧光检测。比例尺：20毫米。(F)攻击小体评估（上）及Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴脑额叶Ab（4G8）免疫荧光检测（下）。比例尺：20毫米。(G)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴脑额叶高尔基体染色分析。比例尺：20毫米。(H)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴脑海马区IBA-1、DCX和LAP2免疫荧光检测。比例尺：20毫米。图(D)-(H)中的定量数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验。图(D)-(G)中显示了IBA-1和LAP2的p值，图(H)中显示了DCX的Mann-Whitney检验p值。Y-Ctrl组样本量n=5-6；M-Ctrl组样本量n = 3；O-Ctrl组样本量n = 5；O-Met组样本量n=5-6（见图(D)-(H)）。另请参阅图S7和表S4。
图7.二甲双胍通过依赖Nrf2的机制延缓神经元衰老
(A) 体外培养hNeuron的二甲双胍抗衰老作用示意图，详细说明了所采用的处理方案。Veh为溶剂对照；Met为二甲双胍。
(B) Veh或Met处理35天后hNeuron的SA-β-gal染色评估。比例尺：20µm。
(C) Veh或Met处理35天后MAP2标记hNeuron中抗体（4G8）的免疫荧光分析。箭头指示4G8阳性神经元。比例尺：20µm和5µm（放大图像）。
(D) Veh或Met处理35天后hNeuron中p-Nrf2水平的Western blot分析。
(E) Veh或Met处理35天后MAP2标记hNeuron中p-Nrf2的免疫荧光检测。比例尺：20µm和5µm米（放大图像）。
(F) Veh或Met处理35天后MAP2标记hNeuron中4-HNE的免疫荧光分析。比例尺：20µm和5µm（放大图像）。
(G) si-NC或si-Nrf2 hNeuron在扩展培养中的二甲双胍治疗示意图，标注了具体处理方案。(H)Veh或Met处理21天后MAP2阳性si-NC或si-Nrf2 hNeuron中p-Nrf2的免疫荧光分析。比例尺：20µm。
(H) Veh或Met处理21天后si-NC或si-Nrf2 hNeuron中SA-b-gal染色评估。比例尺为20µm。
(J)定量分析经Veh或Met处理后第21天si-NC或si-Nrf2 hNeuron中p-Nrf2的平均荧光强度及SA-β-gal阳性细胞比例。
(K)野生型（WT）或Nrf2 E82G hNeuron在扩展培养中接受二甲双胍治疗的示意图，如图所示。
(L)经Veh或Met处理后第35天MAP2标记的WT或Nrf2 E82G hNeuron中p-Nrf2的免疫荧光检测。比例尺为20µm。
(M)经Veh或Met处理后第35天WT或Nrf2 E82G hNeuron中SA-β-gal染色评估。比例尺为20µm。
(N)经Veh或Met处理后第35天WT或Nrf2 E82G hNeuron中p-Nrf2的平均荧光强度及SA-b-gal阳性细胞比例的定量分析。
(O)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴脑（FL）中p-Nrf2与NeuN的免疫荧光检测。比例尺为20µm。
(P)Y-Ctrl、M-Ctrl、O-Ctrl和O-Met猴脑（FL）中4-HNE和NeuN的免疫荧光分析。比例尺为20µm。
图(B)-(F)、(J)和(N)-(P)中的量化数据以均值±标准误表示，(B)-(F)采用双尾Student‘s t检验p值，(J)和(N)-(P)采用单因素方差分析结合Tukey多重比较检验p值。各组n = 3个生物学样本：(B)-(F)、(J)和(N)；Y-Ctrl组n = 6；M-Ctrl组n = 3；O-Ctrl组n = 5；O-Met组n=6（见(O)和(P)）。
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