原文链接：Cell Stem Cell. 2025 Oct 14:S1934-5909(25)00339-X. doi: 10.1016/j.stem.2025.09.008. Online ahead of print.

Vitamin C conveys geroprotection on primate ovaries

维生素C对灵长类动物的卵巢具有衰老保护作用

图解摘要：

亮点：

• 口服维生素C可有效延缓灵长类动物卵巢衰老

• 维生素C能显著缓解氧化应激、细胞衰老及卵泡耗竭

• 单细胞衰老时钟显示卵母细胞与体细胞均呈现年轻化趋势

• NRF2激活是维生素C发挥功效的关键机制

简短总结：

Jing等人研究表明，口服维生素C可延缓非人灵长类动物的卵巢衰老，能缓解关键衰老特征并恢复卵巢细胞与分子特征。这些抗衰老效应部分通过激活NRF2通路实现，表明维生素C可作为应对生殖衰老的实用营养策略。

摘要：

卵巢衰老对女性生殖健康具有关键影响，不仅关系到治疗策略的选择，更直接影响着患者的生活质量。然而，单一药物能否有效延缓灵长类动物卵巢衰老的潜力，目前仍缺乏充分研究。我们历时3.3年的猴类研究证实，口服维生素C可显著延缓卵巢衰老。维生素C能有效抑制氧化应激和卵泡耗竭等关键衰老生物标志物。通过单细胞转录组时钟技术，我们发现维生素C能使卵母细胞的生物年龄缩短1.35年，体细胞年龄缩短5.66年。这一效果部分通过NRF2信号通路实现，该通路可缓解卵巢细胞衰老和炎症反应。本研究揭示了维生素C在延缓灵长类动物卵巢衰老中的重要作用，为开发人类卵巢衰老干预方案提供了重要参考依据。

前言

卵巢是女性最早出现衰老的器官之一，通常在三十岁左右开始衰退，对生育能力造成严重影响1-6。这种退行性变化表现为卵泡储备减少和卵母细胞质量下降，导致卵巢再生能力受损，难以维持生殖功能1,2,7-10。除了缩短生育期，卵巢衰老还会引发激素失衡，包括雌激素和孕激素等性激素分泌不足，以及卵巢激素反应性降低，进而导致月经紊乱，最终引发更年期11-14。因此，卵巢衰老及其伴随的激素失衡会显著影响女性整体健康，增加心血管疾病及其他与生殖衰老相关慢性病的风险1,7,15,16。

氧化应激是导致生物体衰老及相关疾病发生的关键因素7,15,17-23。我们的研究与其他研究共同发现，抗氧化基因表达下调及由此引发的氧化损伤增加，是卵巢衰老的重要标志和驱动因素8,24-29。这一发现引出了一个关键问题：是否仅需单一抗氧化干预就能延缓卵巢衰老。维生素C（VC）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的微量营养素，以其安全性及强效抗氧化特性著称，在精神障碍（如重度抑郁症、精神分裂症、焦虑症和阿尔茨海默病）及心血管疾病（如高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血和心脏衰竭）等多种病症中展现出治疗潜力30-34。尽管其重要性不言而喻，但人体无法内源性合成维生素C，需通过饮食或补充剂进行外源性补充。然而，关于维生素C补充能否延缓卵巢衰老的关键问题，以及最佳剂量、治疗时机和给药策略等核心参数仍悬而未决。非人灵长类动物（NHPs），尤其是同样缺乏内源性维生素C合成能力的猴子，已成为评估维生素C对卵巢衰老保护作用的重要临床前模型。利用这一模型对于探索延缓卵巢衰老的潜在方法、疗效及机制至关重要，为针对人类卵巢衰老及相关疾病的靶向干预奠定基础。

在我们针对老年雌性食蟹猴开展的3.3年纵向研究中，口服维生素C（VC）对灵长类卵巢衰老展现出积极影响。组织学评估显示，VC能有效缓解氧化损伤并减少卵泡流失。通过开发灵长类卵巢特异性单细胞转录组衰老时钟，我们发现VC可延缓多种卵巢细胞类型的衰老进程。此外，VC通过激活核因子红系衍生2样2（NRF2）信号通路，部分保护人类卵巢内皮细胞和基质细胞免受衰老影响。本研究首次证实单一化合物可延缓灵长类卵巢衰老，为预防和治疗与卵巢衰老相关的退行性疾病提供了重要理论依据。

结果

维生素C的补充在灵长类动物的卵巢中具有抗衰老作用

为了评估长期口服VC补充剂延缓灵长类动物卵巢衰老的潜力，我们对12-16岁（大致相当于人类40-53岁）的雌性食蟹猕猴（Macaca fascicularis）进行了一项为期3.3年（相当于大约人类10年）的研究。考虑到猕猴属物种通常在25岁左右经历绝经期，因此选择12-16岁作为干预的最佳时机。研究启动时，将猴子按年龄分组并随机分配至维生素C干预组（O-VC）或对照组（O-Ctrl）。O-VC组每日接受30毫克/千克体重的临床安全剂量维生素C，两组均保持统一的环境和护理标准（图1A）。为量化维生素C对衰老的影响，研究还纳入了年轻组（4岁，相当于年龄13岁）和中年组（11-12岁，相当于人类33-40岁），分别命名为Y-Ctrl和M-Ctrl组（图1A）。

我们前期研究发现，抗氧化蛋白水平下降是灵长类动物卵巢衰老的关键特征8。为此，我们首先检测了这些蛋白的变化，发现VC给药可显著提升老年猴卵巢中抗氧化蛋白的表达水平，包括谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）和异柠檬酸脱氢酶（NADP（+））1（IDH1）（图1B和1C）。相应地，VC能缓解卵巢的年龄相关氧化损伤，表现为8-羟基-2‘-脱氧鸟苷（8-OHdG）标记的DNA氧化损伤减少，以及脂质过氧化产物（尤其是4-羟基壬烯醛4-HNE）的积累减少（图1D和1E）。此外，铁离子作为脂质过氧化物积累的驱动因素44，在老年猴卵巢中出现聚集现象，而VC治疗可逆转这一现象，普鲁士蓝铁染色结果证实了这一点（图1F）。我们还观察到，长期VC治疗可显著减少卵巢基质区的纤维化程度（图1G）。最值得注意的是，VC补充可缓解老年猴的年龄相关卵泡耗竭现象。这通过次级卵泡和窦状卵泡数量的增加得到验证，同时初级卵泡数量也呈现上升趋势（图1H）。与这些发现一致，VC治疗可逆转抗穆勒氏管激素（AMH）表达的年龄相关性下降（图1I）。这一结果是高度相关的，因为AMH是由窦前和窦早期卵泡表达分泌的，是卵巢储备的一个公认的标志45。同时，在经VC处理的老年卵巢中，萎缩卵泡比例呈现下降趋势（图1H）。除检测卵母细胞数量外，我们还评估了VC对卵母细胞质量的影响。正如既往研究证实的8,46,47，线粒体生物合成与氧化磷酸化能力是决定卵母细胞功能的关键因素。结果显示VC处理显著增强了电子传递链活性（图1J），这通过细胞色素c氧化酶亚基IV（COX4）的上调得到证实——该亚基是线粒体复合物IV的核心组成部分48,49。综合来看，这些研究结果证实，长期使用VC（维生素C）可有效延缓灵长类动物的卵巢衰老。

VC减缓灵长类卵巢转录组衰老时钟

为探究VC治疗对卵巢衰老过程中细胞类型特异性基因表达变化的影响，我们对不同年龄组的食蟹猴卵巢进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图2A）。卵母细胞分析采用改良的单细胞标记逆转录测序（STRTseq）技术8,50-52，体细胞分析则使用10x Genomics Chromium平台（图2A）。经过严格的质量控制后，我们从97,555个单细胞中获得了高质量转录组数据，包含270个卵母细胞和97,285个体细胞，用于后续分析（图2B–2F及S1A–S1F）。通过我们建立的分析流程8，我们鉴定出四种不同的卵母细胞亚型，标记为簇1至4（C1–C4）（图2B）。卵母细胞内的基因轨迹分析揭示了反映卵泡发生序列的转录组特征。与我们先前的研究结果一致8，促进卵泡发育的基因（如ZP1和GDF9）、减数分裂M期相关基因（如WEE2和AURKA）以及DNA甲基转移酶（DNMT1和DNMT3A）在从亚型C1到C4的过程中逐渐上调（图2C和S1C）。相反，如ATP6和COX2等在原始卵泡中高表达的基因则在从亚型C1到C4的过程中逐渐下调（图2C和S1C）。此外，对簇特异性基因的功能富集分析揭示了与卵泡发育各阶段相关的独特生物学过程（图2D）。例如，C1特异性基因在ATP从ADP生成过程中功能富集，而C4特异性基因则主要与减数分裂I相关（图2D）。这些结果表明，卵母细胞C1-C4分别对应原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡。在体细胞区室中，我们鉴定出九种具有独特转录组特征的细胞群。通过经典标记基因表达分析8,53，我们在卵泡区域识别出两种不同细胞群：颗粒细胞（GCs，标记为AMH和BEX1）和卵泡膜细胞（TCs，标记为STAR和ANPEP），以及七种非卵泡区域细胞（图2E；表S1）。这些细胞包括卵巢表面上皮细胞（OSEs，标记为EPCAM和KRT19）、内皮细胞（ECs，标记为VWF和CDH5）、平滑肌细胞（SMCs，标记为TAGLN和MYH11）、干细胞（SCs，标记为TCF21和DCN），以及免疫细胞（巨噬细胞[Mac]，标记为CD68和CD14；自然杀伤T细胞[NKTs]，标记为NKG7和CD3D）。通过对每种体细胞类型中前50个标记基因的功能表征，我们进一步阐明了其独特生理功能的转录特征（图2F）。例如，颗粒细胞富集的基因与生殖结构发育相关，卵泡膜细胞特异性基因与类固醇生物合成相关，而干细胞特征基因则参与细胞外基质的组织形成（图2F）。

随后，我们采用弹性网络模型开发了灵长类特异性卵巢单细胞转录组衰老时钟54-57。我们整合了年轻、中年及老年不同年龄组的数据，构建了带惩罚项的线性模型（详见STAR方法）。通过该模型，我们估算了各卵巢细胞类型的生物学年龄（sc-transcriptAge），从而计算出ΔAge——即预测的生物学年龄与猴子实际生理年龄的差异。此外，我们定义ΔAgeDiff来表征经VC处理组与对照组老年猴之间ΔAge的差异（详见STAR方法）。这种方法使我们能够评估VC治疗对不同卵巢细胞类型的老年保护作用，如其sc-transcriptAge的降低所示（图2G-2J和S1G；表S2）。值得注意的是，卵母细胞在VC处理后sc-transcriptAge呈现下降趋势，整体平均减少1.35年（图2G）。具体而言，初级卵泡和次级卵泡中的卵母细胞显示出最显著的抗衰老效果，分别使年龄降低3.80岁和3.04岁（图2H和2I）。原始卵泡的年龄降幅为1.44岁（图2H和2I）。对所有体细胞类型的分析显示，VC治疗使体细胞转录年龄平均降低5.66岁，充分证明其广谱抗衰老效果（图2G）。在各类体细胞中，GCs、ECs和SCs对VC治疗反应尤为强烈，预测的生物年龄分别降低7.96岁、6.99岁和6.05岁（图2H-2J和S1G）。综合来看，这些发现表明VC治疗对老年灵长类动物卵巢中的生殖细胞和体细胞均具有年轻化作用，可能有助于恢复卵巢功能。

VC在衰老灵长类动物卵巢中恢复单细胞转录谱

为深入探究VC在灵长类卵巢中的抗衰老潜力，我们首先采用时序Mfuzz c-means聚类方法，从卵母细胞和体细胞中鉴定出四种不同的衰老相关基因表达模式（图3A-3D及S2A-S2C；表S3）。其中，模式U包含持续上调的基因，模式D为持续下调的基因，模式UD呈现先上调后下调的基因特征，模式DU则表现为先下调后上调的基因分布（图S2A-S2C）。值得注意的是，模式U相关基因与炎症反应和细胞凋亡通路密切相关，而模式D基因则富集于DNA修复和染色体组织调控（图S2D；表S4）。VC处理使卵母细胞中约38.5%的模式U基因（救援下调）和42.1%的模式D基因（救援上调）恢复表达（图3A）。在体细胞中，VC诱导的基因表达模式逆转率分别为：模式U基因47.8%，模式D基因18.5%（图3A；表S3）。特别值得关注的是，非卵泡区域的体细胞显示出显著的年龄相关基因表达谱恢复（图3B-3D）。功能注释显示，VC处理不仅缓解了与衰老相关的炎症反应和程序性细胞死亡，还促进了DNA修复（图3E和S2E；表S4）。与此同时，我们对衰老相关关键分子变化的全面评估显示，VC能显著增强抗氧化信号通路相关基因的表达（图3F和S3A）。相反，VC会降低与衰老、衰老相关分泌表型（SASP）、细胞凋亡及多种炎症通路相关的基因集表达谱（图3F和S3A）。这些通路包括趋化因子和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路（图S3A）。此外，VC介导的激素通路相关基因（包括雌激素反应信号）上调，进一步证实了其改善卵巢功能的潜力（图S3B）。通过分析转录因子调控网络，我们识别出参与衰老转录组程序重焕青春的关键转录因子（图S3C）。值得注意的是，线粒体未折叠蛋白反应（mtUPR）58,59相关的激活转录因子4（ATF4）以及JAK-STAT信号通路60中的关键促炎转录因子STAT3，在卵巢衰老过程中均呈现上调。然而，VC补充剂能有效缓解这些上调现象（图S3C），表明其具有对抗衰老相关变化的保护作用。在对VC挽救基因与卵巢病理相关基因的综合分析中，我们发现重叠基因，特别是参与炎症反应的SERPINE1和CHI3L1（图S3D）61-63。我们通过免疫荧光技术进一步验证了这些基因蛋白水平的变化（图S3E和S3F）。

组织学分析结果一致表明，VC治疗显著增强了卵巢组织的细胞内源性抗氧化能力，这通过磷酸化NRF2（p-NRF2）水平升高64,65和p21阳性衰老细胞数量减少（图3G、3H）得到证实。此外，VC还表现出抗炎作用，具体表现为下调干扰素基因刺激因子（sting）的表达——该因子是先天免疫反应的关键启动因子66-69（图S3G），同时抑制S100A9等促炎因子的活性70,71（图3I）。值得注意的是，VC治疗还能减少衰老卵巢组织中免疫球蛋白G（IgG）的蓄积（图S3H），这种蛋白标记物已被证实既是衰老的标志物，也是引发炎症的驱动因素72,73。更进一步，VC治疗还能缓解衰老卵巢组织中凋亡细胞的聚集，这一点通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色实验得到验证（图3J）。综上所述，这些发现表明VC在对抗卵巢年龄相关性退化方面具有潜在价值。

VC使灵长类卵巢ECs恢复活力

血管系统对卵巢功能至关重要，它通过输送氧气、营养物质和激素来支持卵巢内的卵泡发育、排卵及黄体功能74。值得注意的是，由于老年猴的内皮细胞（ECs）表现出显著的年龄相关性改变——包括衰老、SASP因子（亦称衰老因子75）、氧化应激反应和炎症反应等已知衰老标志物的明显变化（图4A），这些细胞在我们的研究中成为重点关注对象。值得注意的是，VC干预有效缓解了内皮细胞的这些衰老相关改变，表明其作为治疗血管衰老的潜在药物76,77（图4A）。与这些观察结果一致的是，VC治疗还降低了预测的ECs的生物年龄近7年（图2H和2J）。此外，我们的研究结果表明，VC能够恢复猕猴卵巢ECs中因年龄变化而改变的基因表达谱。具体而言，VC成功挽救了35.6%的U型模式基因（下调恢复）和15.6%的D型模式基因（上调恢复）的表达（图4B；表S4）。为验证VC对卵巢血管的保护作用，我们采用厚切片技术对卵巢血管进行了三维成像（图4C）。定量分析进一步显示，VC治疗显著缓解了老年猕猴卵巢中与衰老相关的ECs损耗（图4C）。此外，VC还减轻了猕猴ECs的衰老现象，表现为核纤层和异染色质完整性增强，这一结果通过核纤层蛋白B1和H3K9me3的上调得到证实（图4D和4E）。

鉴于衰老细胞通过SASP诱导慢性炎症，我们系统研究了关键炎症通路的年龄相关性改变（图4F和S4A；表S4）。研究发现，在老年非人灵长类动物卵巢内皮细胞中，参与炎症反应、血管炎（血管炎症）、主要组织相容性复合体（MHC）II类抗原呈递及趋化因子信号通路的基因表达均显著上调（图4F和S4B）。值得注意的是，VC治疗可有效缓解这些与衰老相关的炎症反应（图4F和S4B）。与这种抗炎作用相一致的是，VC给药显著抑制了老年卵巢血管系统中血管细胞黏附分子1（VCAM1）的上调——该分子作为炎症信号传导和白细胞跨内皮迁移的关键调控因子79（图4G）。综合来看，这些结果表明VC通过多种机制延缓灵长类卵巢血管衰老，其核心作用机制在于缓解内皮细胞衰老并抑制炎症反应。

VC通过部分激活NRF2来改善人卵巢EC衰老

为验证VC对人类卵巢细胞是否具有直接的抗衰老保护作用，我们首先在人卵丘内皮细胞（EC）的复制性衰老模型中进行测试（图5A）。结果显示，280 μM VC处理可降低衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性和p21阳性细胞比例，同时促进细胞增殖并增强异染色质稳定性（图5B-5E及S4C）。细胞衰老缓解还表现为DNA损伤反应标志物γH2A.X和53BP1水平下降（图5F）。此外，VC能恢复复制性衰老EC线粒体功能，表现为线粒体质量增加和ATP生成增强（图5G、5H）。进一步研究发现，VC抑制了与脂质过氧化和铁死亡相关的关键酶——酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）的上调（图5I），并同步减少了4-HNE等脂质过氧化产物的积累（图5J）。值得注意的是，VC治疗显著缓解了EC衰老引发的炎症表型，具体表现为肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达下调、细胞表面黏附分子如VCAM1和细胞内黏附分子-1（ICAM-1）表达减少，从而降低了外周血单核细胞的黏附能力（图5K-5M）。在一项独立实验中，我们通过模拟与卵巢衰老相关的氧化和炎症微环境，将人类卵巢内皮细胞暴露于过氧化氢（H2O2）和一组促炎因子，包括白细胞介素-6（IL-6）、TNF-α和干扰素（IFN）γ，这些因子均可导致内皮细胞衰老。在此条件下，我们再次观察到VC能有效延缓内皮细胞衰老（图S4D和S4E）。这些结果与我们在这些细胞的复制性衰老模型中的观察结果一致（图5B）。

基于我们先前在猴卵巢组织中发现VC能激活细胞内NRF2磷酸化（图3G）的研究结果，我们进一步探究了这种经典抗氧化剂56,64,82是否通过促进NRF2介导的抗氧化转录程序来发挥其作用。正如预期，用VC处理人卵巢上皮细胞后，p-NRF2水平显著升高（图5N）。相应地，我们观察到VC处理后NRF2靶向的细胞保护基因表达上调（图5O和5P），包括GPX1和NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）83,84。通过小干扰RNA（siRNA）敲低NRF2后，VC诱导的其经典靶基因（GPX1和NQO1）上调现象消失，同时氧化损伤标志物也同步增加（图5Q–5T和S4F–S4H）。值得注意的是，敲低NRF2会完全消除VC的抗衰老效应，导致细胞衰老标志物重新显现，包括SA-β-Gal活性升高、增殖能力受损及表观基因组稳定性下降（图5U、5V、S4I和S4J）。相反，过表达NRF2则复制了VC的抗衰老效果，抑制细胞衰老并恢复年轻化标志物（图5W–5Z、S4K和S4L）。这些发现表明，VC对人卵巢上皮细胞的抗衰老作用至少部分通过激活NRF2抗氧化通路实现。

VC通过部分激活NRF2恢复人卵巢SCs

与我们在灵长类卵巢ECs中的发现类似，我们也观察到VC可以恢复灵长类卵巢SCs的活力，这些基因对卵巢组织结构和卵泡微环境的形成至关重要27,85。单细胞转录组数据显示，在老年猴卵巢干细胞中，VC可恢复38.2%的U型模式基因（rescuedown）和16.2%的D型模式基因（rescue-up）的表达（图6A；表S4）。这种全面的基因表达重编程机制，从分子层面反映了VC的保护作用，包括降低氧化应激反应、抑制未折叠蛋白反应（UPR）以及减轻炎症反应（图6B和S5A；表S4），从而有助于建立年轻化的卵泡微环境。与灵长类卵巢组织的观察结果一致，VC治疗在人类卵巢干细胞中也表现出抗衰老效应，表现为衰老标志物减弱、细胞增殖增强以及多种分子衰老标志物的缓解（图6C-6M）。与人类卵巢上皮细胞类似，VC治疗还能促进人类卵巢干细胞中NRF2的磷酸化并激活其靶基因（包括GPX1和NQO1）（图6N-6P）。NRF2敲低会沉默其靶基因、加剧氧化损伤并抵消VC的抗衰老活性（图6Q-6V和S5B-S5F），而NRF2过表达则复制了VC的保护作用（图6W-6Z、S5G和S5H）。这进一步表明，作为VC下游事件的NRF2激活，至少部分介导了其在不同灵长类卵巢细胞类型中的抗衰老作用。

讨论

卵巢衰老是一个复杂且多维的过程，受多种生物和环境因素影响，其中氧化应激及其引发的损伤是关键因素8,53,86。猴类与人类在卵巢衰老模式上具有相似性8,53,87-89，这使得在猴子身上开展的干预研究对改善人类女性生殖健康具有重要参考价值。VC作为广泛使用的水溶性膳食补充剂，在医疗和营养领域均有应用，常用于治疗多种疾病41-43,90,91。然而迄今为止，关于VC促进人类健康卵巢衰老的因果关系证据仍较为匮乏。鉴于小鼠能够内源性合成VC（而人类不具备此能力），且其VC代谢特征与人类相似92，猴类已成为研究VC补充剂潜在健康益处最可靠的动物模型。

通过整合组织病理学表型分析与分子钟检测的多维度研究方法，我们揭示了VC对卵巢衰老在组织和分子层面的保护作用。然而，由于非人灵长类动物生殖周期较长、个体差异显著且社会动态复杂，评估其生育功能以评价卵巢健康存在诸多挑战，需要大样本量和长期观察93-95。鉴于这些局限性，本研究建立了评估灵长类动物卵巢生物年龄的系统性框架，为当前针对VC及其他靶向卵巢衰老药物治疗的研究提供了重要参考。

卵巢血管系统对滋养组织和调节炎症至关重要96-98。在我们的研究中发现，作为血管系统守门人的内皮细胞，在老年非人灵长类动物卵巢中会积累氧化应激损伤。这种损伤会引发与衰老相关的炎症表型，其特征是衰老相关因子（senokine）分泌量持续升高。这种表型可能破坏内皮细胞完整性，从而促进巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞在衰老卵巢中的募集、迁移和聚集96。综合来看，这些变化可能形成一个炎症性生态系统，驱动卵巢衰老进程，加剧组织损伤，并最终加速卵巢退化53,99-101。

氧化应激是导致衰老和炎症的多种触发因素中的关键机制102,103。由铁积累、线粒体呼吸作用和NADPH氧化酶活性产生的活性氧会损伤各类生物分子，引发脂质过氧化、蛋白质与核酸的氧化修饰，以及多种异常分子产物104，这些变化共同驱动细胞衰老。与此同时，氧化应激通过直接或间接激活核因子κB（NF-κB）信号通路（例如通过刺突蛋白途径参与），从而促进促炎基因的表达105-108。我们的研究表明，VC作为一种临床上可获取的抗氧化剂109，能在多种人类卵巢细胞中发挥抗衰老保护作用。值得注意的是，我们的研究证实口服VC可有效延缓灵长类动物的卵巢衰老，这一效果至少部分通过激活NRF2介导。这些关键发现表明，灵长类动物的卵巢衰老现象对药物干预具有敏感性。该研究不仅为延缓生理性的卵巢衰老、改善老年群体的生殖健康提供了新思路，更为临床早发性卵巢功能不全患者的治疗策略开发开辟了潜在路径。

研究局限性

虽然我们的研究初步表明，口服VC补充剂能在非人灵长类动物模型中延缓卵巢衰老，但仍需注意以下局限性：样本量较小、缺乏血浆激素年轻化评估指标，以及无法评估生殖功能结果。未来需要更大规模队列研究更全面地解决这些问题，特别是通过检测血浆中对卵巢衰老敏感的生物标志物（如AMH）。还需进一步研究以确定最佳剂量和治疗周期，从而最大化治疗效果和转化潜力。尽管存在这些局限，我们的研究结果仍突显了VC的抗衰老特性，并为基于营养素的卵巢衰老干预措施奠定了基础。

图1.长期补充VC延缓非人灵长类动物卵巢衰老(A)食蟹猴长期补充VC的分析流程示意图。（B–E）不同实验组猴卵巢中GPX1(B)、IDH1(C)、8-OHdG(D)的免疫荧光染色及4-HNE(E)的免疫组化染色结果。Ant表示窦状隙，箭头标示8-OHdG阳性细胞。(F)不同实验组猴卵巢中Fe3+的普鲁士蓝染色检测结果。(G)不同实验组猴卵巢的马松三色染色图像，虚线勾勒纤维化区域。(H)不同实验组猴卵巢中不同发育阶段卵泡的H&E染色代表性图像。绿色、蓝色、橙色、棕色和黑色箭头分别对应原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦状隙卵泡和退化卵泡。左图：每平方毫米原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状隙卵泡数量；右图：退化卵泡比例。（I和J）不同实验组猴卵巢中AMH(I)和COX4(J)水平的免疫荧光分析。图(B)–(J)数据以均值±标准误表示，统计采用双尾非配对t检验，p值标注于图中。样本量：Y-Ctrl组5-6只猴；M-Ctrl组3只猴；O-Ctrl组5只猴；O-VC组4-5只猴。比例尺：图(B)–(F)和(J)为20μm；图(G)和(I)为50μm；图(H)的放大图分别为200μm和100μm。

图2.VC干预可延缓非人灵长类动物卵巢中细胞类型特异性转录组衰老时钟(A)灵长类卵巢衰老及VC干预的单细胞图谱构建。(B)基于Harmony1和Harmony2基因表达模式的四个卵母细胞亚型点图，C1-C4表示四个不同的卵母细胞亚型（簇1-4）。(C)沿Harmony1维度显示卵母细胞发育必需的代表性基因相对表达模式。(D)热图展示四种卵母细胞亚型中前50个亚型特异性基因的表达谱（左），柱状图呈现这些标记基因的代表性术语（右）。(E)均匀流形近似与投影（UMAP）图显示卵巢体细胞内不同细胞类型的分布情况。(F)热图展示各类体细胞类型中前50个标记基因的表达谱（左），柱状图呈现这些标记基因的代表性术语（右）。(G)点图与配对箱线图分别展示单个卵母细胞（左）和体细胞（右）的单细胞转录组年龄（sc-transcriptAge），其中VC诱导的sc-transcriptAge降低效果尤为显著。MAE（平均绝对误差）。(H)环形柱状图展示了VC诱导的猴卵母细胞亚型（左）和卵巢体细胞类型（右）中sc-transcriptAge的降低。（I和J）点图显示预测年龄，箱线图显示VC诱导的sc-transcriptAge降低情况，分别对应四个卵母细胞亚群(I)和卵巢体细胞类型(J)。MAE（平均绝对误差）。另见图S1及表S1、S2。

图3.VC重置非人灵长类动物卵巢中与年龄相关的基因表达(A)折线图展示了卵母细胞和体细胞中年龄依赖性基因表达模式，以及VC干预所调节的表达模式。“救援下调”表示在衰老过程中上调但被VC下调的基因，“救援上调”表示在衰老过程中下调但被VC上调的基因。实线和色带表示标准化表达量的平均值±标准差。(B)饼状图展示了救援下调和救援上调基因在不同细胞类型中的分布情况。(C)棒状图显示了卵母细胞和体细胞中救援上调和救援下调基因的数量。(D)条形图展示了体细胞中救援上调和救援下调基因在卵泡区和非卵泡区的分布情况。(E)网络图展示了不同细胞类型中救援上调和救援下调基因代表性术语的网络关系，饼状图显示了各细胞类型中达到特定术语的基因比例。(F)山脊图展示了经典衰老相关通路的基因集评分，黑色箭头表示VC干预组与对照组相比的中位评分变化方向（左移：下调，右移：上调），Wilcoxon秩和检验p值已标注。（G-J）免疫荧光分析显示了猴卵巢中p-NRF2(G)、p21(H)、S100A9(I)和TUNEL染色(J)在各组中的表达情况。箭头标示阳性细胞。图(G)–(J)中的定量数据以均值±标准误表示。统计学比较采用双尾非配对t检验，p值标注于各图中。实验组样本量：Y-Ctrl组6只猴；M-Ctrl组3只猴；O-Ctrl组5只猴；O-VC组4-5只猴。Ant表示窦。比例尺：图(G)中50和20μm（放大图），图(H)–(J)中100和20μm（放大图）。另见图S2、S3及表S3、S4、S5。

图4.VC治疗可恢复灵长类动物卵巢衰老血管系统活力(A)点状图展示不同细胞类型中随年龄增长上调的通路数量（左）及维生素C显著逆转的比例（右）。热力图呈现平均通路评分差异，左侧为随年龄增长上调的通路，右侧为维生素C逆转的通路。通过Wilcoxon秩和检验并进行错误发现率（FDR）校正评估显著性：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

图5.VC治疗可激活衰老的人类卵巢上皮细胞(A)VC对体外培养的人类卵巢上皮细胞的抗衰老效果示意图，详细说明了所采用的治疗方案。（B–G）SA-β-Gal(B)、p21(C)、Ki67(D)、H3K9me3(E)、γH2A.X和53BP1(F)以及MitoTracker(G)染色分析在非衰老组（nonsen）、衰老-载体组（sen-veh）和衰老-VC组（sen-VC）的人类卵巢上皮细胞中的应用。（H-K）ATP含量分析(H)、ACSL4(I)、4-HNE(J)染色及TNF-αELISA(K)在各组人类卵巢上皮细胞中的检测结果。(L)RT-qPCR分析各组人类卵巢上皮细胞中VCAM1和ICAM1 mRNA的表达水平。(M)各组人类卵巢上皮细胞的外周血单核细胞（PBMC）黏附实验结果。(N)各组人类卵巢上皮细胞中p-NRF2免疫染色分析。(O)各组人类卵巢上皮细胞中NQO1 mRNA表达水平的RT-qPCR分析。(P)各组人类卵巢上皮细胞中GPX1免疫染色分析。(Q)转染si-NC或si-NRF2的人类卵巢上皮细胞VC治疗示意图，详细说明了所采用的治疗方案。(R)各组人类卵巢上皮细胞中NRF2蛋白水平的Western blot分析。（S-V）GPX1(S)、4-HNE(T)、p21(U)(H)各组人卵巢上皮细胞中H3K9me3(V)的免疫染色分析。(W)经Lentivirus载体转导表达Luc或NRF2的人卵巢上皮细胞中NRF2的免疫染色分析。(X)经Lentivirus载体转导表达Luc或NRF2的人卵巢上皮细胞中NQO1 mRNA表达水平的RT-qPCR分析。（Y–Z）经Lentivirus载体转导表达Luc或NRF2的人卵巢上皮细胞中p21(Y)和H3K9me3(Z)的免疫染色分析。箭头指示阳性细胞。图(B)-(P)和(S)-(Y)中的定量数据以均值±标准误表示。图中标注了p值。统计学比较采用双尾非配对t检验或Wilcoxon秩和检验。图(B)–(D)、(F)–(P)、(R)–(U)和(W)–(Y)中每组n=3–4个生物学样本。图(E)、(V)和(Z)中H3K9me3免疫荧光分析每组n≥50个细胞。比例尺：图(B)–(G)、(I)、(J)、(M)、(N)、(P)和(S)–(Z)均为20μm。另见图S4和表S6。

图6.VC治疗可恢复人类卵巢干细胞衰老状态(A)维恩图展示VC治疗后猴卵巢干细胞中修复基因与抑制基因的比例分布（上图）。柱状图呈现干细胞中代表性抑制基因的特征性术语（下图）。(B)脊线图显示干细胞中衰老相关通路的基因集评分。黑色箭头指示VC干预组相较于对照组的中位数评分变化方向（左移：修复基因优势）。(C)VC对体外培养人卵巢干细胞的抗衰老保护作用示意图，详细说明了所采用的处理方案。（D-O）SA-β-Gal(D)、p21 (E)、Ki67 (F)、H3K9me3 (G)、γH2A.X和53BP1 (H)、MitoTracker染色(I)、ATP含量分析(J)、ACSL4 (K)、4-HNE染色(L)、TNF-α ELISA (M)以及p-NRF2 (N)和GPX1 (O)染色分析在非衰老组（non-sen）、衰老对照组（sen-veh）和衰老VC组（sen-VC）人卵巢干细胞中的结果。(P) RT-qPCR分析不同组别人卵巢干细胞中NQO1 mRNA表达水平。(Q)VC处理方案示意图，详细说明了转染si-NC或si-NRF2的人干细胞处理方案。(R) Western blot分析不同组别人干细胞中NRF2蛋白水平。（S-V）人卵巢干细胞中GPX1 (S)、4-HNE (T)、p21 (U)和H3K9me3 (V)免疫染色分析结果。(W)通过慢病毒载体转导Luc或NRF2的人卵巢干细胞中NRF2免疫染色分析。(X) RT-qPCR分析不同组别人卵巢干细胞中NQO1 mRNA表达水平。（Y和Z）慢病毒载体转导Luc或NRF2的人卵巢干细胞中p21 (Y)和H3K9me3 (Z)免疫染色分析。箭头指示阳性细胞。(D)-(P)和(R)-(Y)中的定量数据以均值±标准误表示。统计学比较采用双尾非配对学生t检验或Wilcoxon秩和检验。各组数据的p值已在图中标注。在(D)-(F)、(H)-(P)、(R)-(U)和(W)-(Y)图中，每组生物样本量为3-4个。在(G)、(V)和(Z)图的H3K9me3免疫荧光分析中，每组细胞数≥50个。比例尺：(D)-(I)、(K)、(L)、(N)、(O)及(S)-(Z)图均为20 μm。详见附图S5及表S4、S5、S6。