来源： Wang Z , Chen Z , Jiang Z ,et al.Cordycepin prevents radiation ulcer by inhibiting cell senescence via NRF2 and AMPK in rodents[J].Nature Communications, 2019, 10(1):2538.DOI:10.1038/s41467-019-10386-8.

虫草素通过激活NRF2和AMPK抑制啮齿类动物细胞衰老，从而减轻放射性溃疡

Cordycepin prevents radiation ulcer by inhibiting cell senescence via NRF2 and AMPK in rodents

摘要：放射性溃疡的病理机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗药物。在这里，我们证明持续的DNA损伤灶和细胞衰老参与了辐射溃疡的发展。此外，我们鉴定了虫草素，一种天然核苷类似物，作为一种有效的药物，通过增加NRF2核表达来防止细胞衰老(主要用于皮肤)，以阻止大鼠/小鼠的辐射溃疡(皮肤、肠道、舌头)。虫草素通过与AMPK自抑制结构域附近的α1和γ1亚基结合激活AMPK，促进Keap1的p62依赖性自噬降解，诱导NRF2从Keap1中分离并转移到细胞核中。综上，我们的研究发现虫草素通过激活NRF2和AMPK抑制鼠类细胞衰老来预防辐射溃疡，AMPK或NRF2的激活可能是预防细胞衰老和辐射溃疡的治疗靶点。 

放射性溃疡是骨髓移植或肿瘤放疗大剂量放射常见的不良反应。虽然放射治疗技术有了长足的进步，但患者非癌变组织仍存在不同程度的非特异性放射损伤。这些慢性伤口可以持续数年，给病人带来极大的痛苦。放射性溃疡的病理机制至今未解，也没有有效的治疗药物。

有人提出，辐射是DNA损伤和细胞衰老的重要促成因素，这与受辐射组织的终生延迟修复和再生相一致。细胞衰老是一种由促衰老应激源引起的稳定复制停止的进化保守状态，该应激源也涉及辐射溃疡的发病机制，包括端粒磨损、氧化应激、DNA损伤和蛋白质组不稳定性。衰老细胞通常会增加大量促炎因子的分泌，统称为衰老相关分泌表型(SASP)，它会以旁分泌的方式诱导组织功能障碍和恶化。然而，细胞衰老与放射性溃疡之间的关系尚不清楚。我们推测衰老细胞参与了辐射溃疡的发展，而预防细胞衰老可能是预防辐射溃疡的一种前瞻性策略。

虫草素是腺苷的天然衍生物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、保护神经、防止骨质流失等多种药理活性。然而，虫草素是否能防止辐射引起的细胞衰老仍然是未知的。在这项研究中，我们证明了持续的DNA损伤灶形式和衰老细胞积累在辐射溃疡，这参与了辐射溃疡的发展。此外，我们还发现虫草素是一种天然的NRF2激活剂，通过与AMPK自抑制区域附近的α1和γ1亚基直接相互作用，可直接缓解自身抑制，从而通过阻止细胞衰老来缓解辐射溃疡。 

结果 

1. 放射性溃疡中DNA损伤和衰老细胞积累

本研究为了明确细胞衰老与辐射溃疡之间的关系，我们建立了大鼠高剂量辐射(40 Gy)暴露下皮肤溃疡模型，该模型可导致皮肤红斑、脱屑、溃疡加重(图1a)。大鼠辐照后1小时内，γ-H2AX灶的细胞比例急剧增加(图1b、c和补充图1a-d)。此后，阳性细胞比例逐渐下降，但仍显著高于未辐照对照。持续的DNA损伤反应引起的细胞应激是驱动衰老和年龄相关疾病衰老的一个中心机制。在辐射皮肤切片中，我们观察到辐射暴露10天后SA-β-gal活性急剧增加(图1d)。同样，我们观察到辐射后衰老标记物p16和p21蛋白水平升高(图1e)。衰老细胞代谢活跃，能够通过多种分泌因子与其他细胞相互作用，这也被称为SASP18。我们发现，与未辐照组织相比，SASP因子IL1β、IL6和TNFα在辐照皮肤中显著增加(补充图1e)这些结果表明，放射性溃疡在具有持续性DNA损伤灶的细胞中具有长期持续的作用，导致组织中衰老细胞的广泛积累。

此外，衰老细胞被皮下注射到被辐射的腿。我们发现衰老细胞加速了放射溃疡的发展(图1f)。移植了衰老细胞的辐照腿在第4天开始发红和肿胀，而对照组直到第8天(图1f)。移植衰老细胞的辐照腿在第4天开始脱落，比对照组早4天(图1f)。衰老组皮肤溃疡在第8天出现，对照组皮肤溃疡在第13天出现(图1f)。因此，衰老细胞参与了辐射溃疡的发生发展，我们推测预防细胞衰老可能是缓解辐射溃疡的一种治疗策略。

图1：放射性溃疡中DNA损伤和衰老细胞积累

2. 虫草素对体外细胞衰老和SASP的抑制作用

在此基础上，我们首次建立了辐射诱导的体外成纤维细胞衰老模型，筛选候选药物，特别关注成纤维细胞在溃疡发生发展中起重要作用的抑制细胞衰老的化学小分子。接下来，我们利用我们小组建立的小分子库来筛选潜在的放射性防护候选分子，以便进一步研究。在小分子实验中，我们鉴定出虫草素，一种天然核苷类似物，作为一种有效的缓解剂，可以减少细胞衰老和辐射诱导的溃疡(图2d, e和补充图2a-e)。进一步确定虫草素能否在体外拯救电离辐射的有害影响, 我们在辐照前用200 μM虫草素处理皮肤成纤维细胞3天，发现经虫草素处理的成纤维细胞在辐照早期和晚期DNA损伤反应标志物γ-H2AX水平降低 (图2 a - c)。DNA损伤反应的激活是细胞衰老的主要介质之一，它导致不可逆的生长停滞。因此，我们观察到，辐射后虫草素处理的成纤维细胞(图2d)和人角质形成细胞(HaCaT细胞)中p16和p21蛋白的衰老标志蛋白水平降低(补充图2a)。同样，成纤维细胞(图2e和补充图2b, c)和HaCaT细胞(补充图2d, e)中的SASP和SA-β-gal活性均降低。这些结果表明，虫草素可以通过减少DNA损伤和由此导致的衰老和SASP的诱导来阻止细胞衰老，从而增加细胞的复制能力。在辐射后，细胞的增殖明显减少，但我们发现虫草素能促进辐射后细胞的增殖(补充图2f)。此外，虫草素可防止辐射诱导的细胞凋亡(图2f)。我们也使用H2O2在体外模拟氧化应激引起的细胞损伤，用虫草素预处理的成纤维细胞显示出更好的抗急性氧化应激的能力，更少的凋亡(图2g)。综上所述，虫草素可促进细胞增殖，减少氧化应激后的细胞死亡。

因为每个大的集落都是由一个存活的自我更新的干细胞生长而来。我们发现虫草素提高了辐照后成纤维细胞和HaCaT细胞的集落形成效率(图2h和补充图2g)。这些发现表明虫草素增加了细胞的生存和再生能力，从而保护了辐射引起的再生细胞数量的损失。另一方面, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)可以介导辐射的有害影响，并促进DNA损伤和细胞衰老途径的激活, 我们发现，ROS清除剂n-乙酰半胱氨酸(NAC)处理至少部分地消除了辐射诱导的细胞衰老(补充图2b, c)。通过分析胞质和线粒体活性氧的水平,我们发现，虫草素治疗可防止成纤维细胞辐射后诱导的ROS (图2i)。虫草素处理组HaCaT细胞胞浆ROS也降低(补充图2h)。然后我们检测了参与清除ROS的不同抗氧化剂的水平，发现虫草素处理后，成纤维细胞中SOD1、SOD2、GPX-1和过氧化氢酶的表达均在不同时间增加(图2j)。综上所述，虫草素可能增加细胞的克隆增殖能力和抗氧化能力，并阻止特定细胞衰老机制的激活。

图：2虫草素在体外降低细胞衰老和SASP

3. 虫草素可预防辐射溃疡

考虑到虫草素在体外的显著作用，我们下一步测试虫草素是否可以预防辐射溃疡。建立大鼠皮肤溃疡模型、小鼠肠道溃疡模型和小鼠口腔溃疡模型，对药物的作用进行评价。有趣的是，我们发现虫草素能有效预防辐射诱导的皮肤溃疡和水肿，并增加皮肤细胞恢复和上皮再生(图3a, b)。辐射后的长期影响之一是纤维化，虫草素处理组皮肤的显微分析显示，与对照组相比，三色染色未显示明显的纤维化(补充图3a)。在辐射诱导的肠道溃疡中，我们发现虫草素处理组的肠道结构保存较好(图3c)，存活的隐窝增加两倍，绒毛更高(图3d)。所有对照小鼠死于辐射后5 - 7天,相比之下,50 - 60%的老鼠虫草素处理小鼠(预防和治疗组的生存率分别为57和48%)辐射后存活至少40天(图3 e),我们没有发现幸存下来小鼠的小肠组织纤维化发展 (补充图3 b)。同时，虫草素几乎完全阻止了放射舌黏膜炎/溃疡的出现(图3f和补充图3c)。舌的组织学分析显示，经辐射虫草素处理的小鼠上皮层保存，尽管观察到辐射相关的组织变化(图3g)。此外，H&E染色显示虫草素对肺、肝、脾、心、肾和肠没有显著影响(补充图12)。有报道称，用雷帕霉素抑制哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)可以通过阻止干细胞衰老，增加原代人口腔角质形成细胞及其常驻自更新细胞的克隆能力，mTOR抑制也可以防止体内游离辐射导致的增生性基底上皮干细胞的丧失，从而保护口腔黏膜的完整性，防止辐射诱导的粘膜炎。然而，与虫草素相比，在单剂量(15 Gy)照射小鼠时，雷帕霉素对粘膜炎没有保护作用(补充图3d)，这表明虫草素治疗给予的保护作用可能比高单剂量雷帕霉素更有效。

图3：虫草素预防辐射溃疡

4. 虫草素可防止体内细胞增殖的丧失

进一步的研究表明，经辐射处理的皮肤、肠道和舌头中γ-H2AX水平显著降低(图4a-c)，表明虫草素可能保护细胞免受体内DNA损伤和氧化应激。与我们的体外结果一致，通过TUNEL检测，我们观察到对照组和虫草处理小鼠/大鼠在辐照皮肤、肠道和舌头上的显著差异(补充图4a-c)。另一方面,我们发现虫草素显著降低辐射诱导SA-βgal+细胞的衰老标记p16, p21蛋白以及受辐射皮肤中衰老相关细胞因子的分泌(图。4 d和补充图5 a, b)。同样,存在表明虫草素显著降低辐射诱导衰老标记p16, p21和肠、舌的SASP (补充图5c-f)。此外,虫草素显著降低辐射诱导SA-β-gal+细胞在小肠和舌模型(补充图6 a, b)。由于皮肤和肠道的高剂量辐射，虫草素处理的大鼠/小鼠血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度明显低于对照组，这通常会引起全身影响 (补充图6 c, d)。通过使用增殖标志物Ki-67或BrdU，我们发现虫草素抑制了辐射诱导的表皮基底层、隐窝和口腔上皮基祖细胞层增殖的阻滞(图5a-c)。如图5d所示，我们发现虫草素抑制了辐射诱导的口腔上皮细胞增殖和上皮祖细胞标记物p63的消失，这表明虫草素减少了辐射引起的干细胞的损耗。这些结果强调了虫草素可能通过抑制再生干细胞的体内衰老而增加增殖能力的可能性。

图4：虫草素在体内防止DNA损伤和细胞衰老

图5：虫草素可防止体内增殖能力的丧失

5. 虫草素依赖于Nrf2抗衰老

为了寻找虫草素细胞衰老保护作用的潜在机制，我们探讨了虫草素治疗成纤维细胞是否会导致分子事件的激活，这通常与延缓衰老。虫草素治疗后,然而, 我们没有观察到FoxO蛋白的表达、核定位或转录激活的增加，以及SIRT家族成员表达的变化 (补充图7 a - c),所有这些已被证明影响寿命和干细胞对压力的反应。核因子红细胞2相关因子2 (NRF2)是一种重要的氧化还原传感器，是抗氧化反应的主要调节因子之一。NRF2结合抗氧化反应元件(AREs)，并激活许多抗氧化基因的转录，这些抗氧化基因被认为可以对抗ROS。我们发现成纤维细胞(图6a)和HaCaT细胞(补充图7d)中NRF2的表达显著增加。虫草素处理的成纤维细胞中，NRF2的核定位(NRF2通路激活的下一步)显著增加，而胞质NRF2组分保持不变(图6b和补充图7e)。同时，成纤维细胞免疫荧光染色显示虫草素增加了细胞核内NRF2的数量(图6c)。此外，虫草素导致虫草素处理的动物核NRF2活性增加(图6d)。丝氨酸40的磷酸化是一种调节修饰，涉及NRF2转位到细胞核和下游蛋白激活。虫草素处理后，成纤维细胞核室中丝氨酸40上的NRF2磷酸化水平增加(图6e)。成纤维细胞中胞浆内的NRF2磷酸化未见变化(补充图7f)。我们分别以肌动蛋白和粘连蛋白为纯化核和胞质部分标记物。

接下来，我们定量了硫氧还蛋白(TXN)的相对含量，它减少了对核NRF2与ARE结合至关重要的半胱氨酸残基，并发现虫草素处理过的成纤维细胞中TXN显著增加(补充图7g)。为了确定NRF2表达、易位和磷酸化增加的功能相关性，我们使用基于荧光素酶的ARE控制基因表达系统来测量NRF2的转录活性。与未处理细胞相比，虫草素显著提高了荧光素酶活性(1-3倍)(补充图7h)。为了进一步证实NRF2的激活，接下来，我们通过qRT-PCR检测虫草素处理的成纤维细胞中NRF2下游靶基因Srx、NAD(P)H脱氢酶醌1 (NQO1)和谷胱甘肽s -转移酶A1 (GSTA1)在不同时间的相对表达量，结果均上调(图6f)。同时，与体外结果一致，虫草素诱导的小鼠/大鼠模型中NRF2靶基因均增加(补充图7i)。通过western blot分析，我们也测量了成纤维细胞、GCLC、GCLM、HMOX1和NQO1中NRF2下游靶点的相对丰度，所有四个靶点的表达均显著增加(图6g)。

为了确定NRF2在虫草素诱导的细胞衰老抑制中的作用，我们通过敲除NRF2来研究虫草素对成纤维细胞的影响。然而，NRF2缺失的细胞经虫草素处理后，p16、p21蛋白水平更高，衰老细胞和SASP水平更高(图6h-j和补充图7j)。NRF2的敲除逆转了虫草素对成纤维细胞克隆能力的保护作用(图6k)，逆转了细胞内ROS生成的减少(图6l)。这些数据表明虫草素诱导的细胞衰老抑制和炎症表型均依赖于NRF2。

为了进一步确定虫草素在体内的潜在机制，我们采用了一种新开发的策略，即使用特异性NRF2抑制剂(ML385)来抑制NRF2的激活。通过western blotting，我们发现ML385有效地抑制了体内NRF2活性(补充图8a)，而H&E染色显示ML385对肺、肝、脾、心、肾和肠的影响不显著(补充图12)。有趣的是，ML385明显阻断了虫草素对辐射诱导的皮肤、肠道和舌头溃疡的保护作用(补充图8c、d和补充图3d)。在辐射诱导的肠溃疡模型中，虫草素ML385组的存活率与对照组相似(补充图3e)。由于辐射溃疡在具有持续性DNA损伤位点的细胞中具有长期持久的作用，这导致衰老细胞的组织广泛积累，我们发现NRF2抑制可逆转辐照皮肤、肠道和舌头中的γ-H2AX水平(图4a-c)。同样，当使用ML385处理时，衰老标记物和SASP表型的水平显著增加(补充图5a-f)。因此，我们进一步证实虫草素缓解辐射溃疡是NRF2依赖性的。

图6：虫草素可防止nrf2依赖的衰老和SASP

6. 虫草素促进Keap1的自噬降解

接下来我们研究虫草素是如何调节NRF2活性的。虫草素在该蛋白上显著诱导NRF2表达，但在mRNA水平上没有诱导(图6a和图7a)。这些数据表明虫草素诱导NRF2的积累，而这不太可能发生在转录水平。因此，我们推测虫草素可能通过调节NRF2的蛋白稳定性来上调NRF2。为了验证这一假设，我们用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)处理细胞。在虫草素处理的成纤维细胞中，在CHX处理后，NRF2蛋白水平如预期的那样，以时间依赖性的方式逐渐下降，然而，在对照细胞中，NRF2的降解更为显著(图7b)。通过分析定量曲线，我们发现在对照细胞中NRF2的半衰期出现在20分钟(min)左右，虫草素处理的细胞中NRF2的半衰期出现在80分钟左右(图7b)，说明虫草素对维持NRF2的稳定性至关重要。

在基础条件下，NRF2的活性受到Kelch-like ECH相关蛋白1 (Keap1)在细胞质中的结合的严格限制。我们发现，在成纤维细胞和HaCaT细胞中，用虫草素预处理的细胞以时间依赖的方式显示Keap1丰度降低(图7c和补充图9a)，而Keap1 mRNA的数量未受影响(补充图9b)。此外，虫草素还导致虫草素处理的动物Keap1活性下降(图7d)。因此，我们推测虫草素对Keap1丰度的下调是由Keap1的降解介导的。两种主要途径介导蛋白降解:泛素-蛋白酶体途径和自噬-溶酶体途径。蛋白酶体抑制剂MG - 132抑制蛋白酶体,没有影响keap1丰富(图7 e), 而虫草素诱导的Keap1丰度的下降被不同的自噬抑制剂所减弱: 氯喹(CQ)(图7f和补充图9c)和3-甲基腺嘌呤(3MA)(图7g和补充图9d)，提示虫草素下调Keap1可能是通过自噬降解介导的。为确定虫草素是否刺激自噬, 我们检测了LC3的脂化，这是自噬的一个特征，将LC3- i亚型转化为电泳更灵活的LC3- ii亚型，发现虫草素在成纤维细胞中表达 (图7 h和补充图9 e)和HaCaT细胞(补充图9)诱导LC3- ii自噬标志物。透射电镜显示虫草素处理后的成纤维细胞形成自噬空泡(图7i)。与这一解释相一致的是，我们进一步研究了自噬的作用。自噬组分ATG7的减少也逆转了keap1蛋白的下降(图7j)。

 自噬可以在特异性自噬调配器的介导下选择性地降解某些底物。已经确定了几个调控Keap1-NRF2相互作用的途径，其中一个涉及到p62，一种自噬底物，它与NRF2竞争结合Keap1。事实上，自噬适配器p62的耗损阻断了虫草素诱导的Keap1降解(图7k)，表明p62依赖的自噬是这种降解的主要途径。另一方面，p62基因敲低逆转了p16、p21蛋白和SA-βgal+成纤维细胞的下降(补充图9f-h)。因此，当虫草素处理keap1时，通过与p62的关联，进而促进NRF2蛋白的积累，keap1似乎是自噬降解的一个靶点。

为了排除Keap1蛋白水平轻微下降的可能性，进一步证明虫草素激活NRF2归因于Keap1的降解，将KEAP1表达质粒转染成纤维细胞后，我们发现虫草素处理后NRF2蛋白水平发生逆转(补充图9i)，表明虫草素以KEAP1依赖的方式激活NRF2。

图7：虫草素通过促进Keap1的自噬降解激活NRF2

图8：虫草素与AMPK的α1和γ1亚基相互作用

7. 虫草素与AMPK的α1和γ1亚基相互作用

为了探讨虫草素激活自噬的潜在机制，我们检测了虫草素处理后调控的信号通路。PI3K/Akt/mTOR通路是自噬过程中最常见的通路之一。通过纤维母细胞和HaCaT细胞中S6的磷酸化评估，虫草素处理降低了mTOR活性(图8a和补充图10a)。此外，虫草素还导致虫草素处理的动物S6活性下降(图8b和补充图10b)。但我们未能检测到成纤维细胞中AKT活性的任何明显变化(图8a)，提示PI3K/AKT通路可能未参与虫草素引起的自噬。根据以前的研究,AMPK磷酸化导致mTOR失活，进而诱导自噬。如图8c所示，虫草素处理显著提高成纤维细胞中磷酸化- AMPK及其下游底物乙酰辅酶a羧化酶(ACC)的水平。我们还发现虫草素处理的HaCaT细胞中AMPK表达升高(补充图10a)。为了验证AMPK在虫草素引起的自噬中的作用，我们用AMPK抑制剂复方C预处理成纤维细胞，结果显示复方C降低了AMPK，上调了mTOR活性，降低了LC3B-I向LC3B-II的转化(图8d)。因此，AMPK激活与虫草素诱导的自噬过程有关。有报道称，AMPK磷酸化NRF2的Ser550残基，结合AMPK介导的GSK3-β抑制，促进NRF2的核积累，以促进抗氧化反应元件(ARE)驱动的基因转激活。然而，我们没有发现GSK3-βSer9显著增加(补充图10c)，因此我们认为，AMPK依赖的Keap1降解是虫草素激活NRF2的主要途径。

接下来，我们验证了AMPK在虫草素诱导的细胞保护能力中的作用，补充化合物C逆转了ROS生成的下降(图8e)，以及在基础条件下和辐射暴露后，虫草素对成纤维细胞克隆能力的保护作用(图8f)。另一方面，AMPK抑制也逆转了p16、p21蛋白和SA-β-gal+成纤维细胞的下降(图8g和补充图10d)。此外,我们使用化合物C抑制AMPK(补充图8 b), H&E染色显示, 化合物C没有显著影响肺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏和肠道(补充图12), 虫草素对辐射诱导的皮肤、肠道和舌头溃疡的保护作用显著逆转(补充图8c、d和补充图3d)，虫草素与复方C组在辐射致肠溃疡模型中的存活率与对照组相当 (补充图3e)。另一方面，当化合物C抑制AMPK时，辐照皮肤、肠道和舌中的γH2AX水平发生逆转(图4a-c)。

同样，当使用ML385处理时，衰老标记物和SASP表型的水平显著增加(补充图5a-f)。

增加细胞内AMP/ATP比值和刺激上游激酶如LKB1和CaMKK2是AMPK的两个主要激活因子。如图8h所示，虫草素处理后细胞内AMP、ADP、ATP浓度及AMP/ATP比值均无明显变化。另一方面，我们没有发现LKB1和CAMKK2的激活发生明显变化(补充图10c)。补充CaMKK2选择性抑制剂STO-609也没有抑制虫草素诱导的AMPK激活(补充图10e)，表明在CaMKK2缺失的情况下虫草素可以激活AMPK。当特定的siRNA降低LKB1的表达时，虫草素对AMPK的刺激作用与之前相同(补充图10f)。综上所述，这些结果表明虫草素可以直接促进AMPK活性，而不是通过刺激上游激酶，或通过改变AMP/ATP的比例。因此，我们假设Asp291是与位点2相对应的关键残基(图8i)。

为了证实AMPKγ1/α1在虫草素诱导的AMPK激活中的关键作用，我们开发了AMPKγ1和AMPKα1特异性siRNA。干扰AMPKγ1特异性siRNA不会在mRNA水平上影响AMPKα1/2亚基的表达水平(补充图10g)，也不会影响其他两个AMPKγ亚型(AMPKγ2/γ3;补充图10 g)。同样，干扰AMPKα1特异性siRNA也不会影响AMPKγ1/2/ 3亚基的表达水平和AMPKα2的转录(补充图10g)。然而，当AMPKγ1或AMPKα1表达被充分抑制时，虫草素对AMPK磷酸化的刺激作用显著降低(图8j)。因此，与AMPK γ1/α1亚基的相互作用可能是虫草素介导AMPK激活的关键机制。

为了验证AMPK-自噬Keap1-NRF2通路在缓解辐射性溃疡中的通用性，我们在皮肤溃疡模型中应用了两种AMPK激动剂(AICAR和二甲双胍)。AICAR和二甲双胍均显示AMPK Thr172位点磷酸化(p-AMPK)增加(补充图11a)，但它们的缓解作用各不相同。 AMP模拟物AICAR对皮肤溃疡有轻微的预防作用，但不如虫草素(补充图11b)，而二甲双胍对皮肤溃疡没有预防作用。这些差异可能与AICAR和二甲双胍激活AMPK的机制不同有关。

讨论

辐射溃疡是由于暴露于射频能量或电离辐射而对皮肤或其他生物组织造成的损伤。这是一个研究较少的问题，对其管理尚无明确的指导方针。与此同时，放射性溃疡不可预测和无法控制的扩展机制还没有完全弄清楚。电离辐射(IR)在体内和体外均能产生高水平的DNA损伤，导致细胞凋亡和衰老。在快速再生的组织中诱导细胞凋亡被认为是导致短期副作用的原因，如骨髓抑制。然而，组织中功能失调性衰老细胞的积累以及祖细胞/干细胞增殖潜能的降低是长期并发症发生的原因。同时，衰老细胞通过分泌衰老相关分泌表型(SASP)，一种广泛的细胞因子、趋化因子、基质重塑蛋白酶和生长因子，间接促进组织功能障碍和恶化。衰老细胞(SCs)随着年龄的增长和遗传毒性应激(如全身照射TBI)的发生而积累。本研究首次证实了放射溃疡中存在持续的DNA损伤灶形成和衰老细胞积累，并发现衰老细胞加速了放射溃疡的发展。这使我们假设，防止细胞衰老可能是一个前瞻性的策略，以减轻辐射溃疡。

虫草素是一种从蛹虫草培养基中分离出来的天然核苷类似物，已被证明具有多种生物学功能，包括抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和抗炎活性。重要的是，虫草素已被证明可减轻年龄相关的氧化应激，并增强大鼠的抗氧化能力。它也被证明通过激活抗氧化防御部分防止大鼠心脏缺血/再灌注损伤。虫草素是一种很有前景的药物，具有潜在的临床应用前景。在本研究中，我们发现虫草素可以通过预防DNA损伤和细胞衰老，有效缓解辐射所致的皮肤、肠道溃疡和粘膜炎，有望帮助患者治疗辐射溃疡

NRF2是一种主要的应激应答因子，通过与ARE基序结合转录激活抗氧化和细胞保护基因。关注NRF2通路是一个合适的策略来延缓衰老进程，激活NRF2对于减轻胃十二指肠溃疡是有用的。我们发现虫草素可以防止辐射诱导的细胞衰老，SASP依赖于nrf2。这些有益的作用是通过促进富含半胱氨酸的Keap1的p62依赖性自噬降解来实现的，Keap1通过Cul3-Rbx1 E3泛素连接酶复合物作为NRF2泛素化的底物适配器。另一方面，根据Hiebert等人的报道，长时间激活NRF2可以促进成纤维细胞的衰老，这些明显的差异可能反映了特定的环境，包括细胞类型、细胞受到的压力以及NRF2激活/抑制达到的确切水平。 AMPK磷酸化导致mTOR失活，进而诱导自噬。在最近的一项研究中，虫草素被确定仅在HepG2癌细胞的脂质调节中通过与γ1亚基相互作用激活AMPK，在这里,在我们的研究中,我们进一步确定虫草素可以通过交互激活AMPK与α1和γ1亚基附近的AMPK 自抑制域直接缓解自抑制, 然后促进Keap1的自噬降解，该机制被证明在预防细胞衰老和缓解辐射溃疡中发挥重要作用。同时，AMPK通过上调抗氧化酶来影响细胞氧化还原状态。然而，AMPK调节抗氧化反应的机制仍然很大程度上未知。我们的研究表明，激活NRF2代表了AMPK调节抗氧化反应的机制，激活AMPK或NRF2可能是预防细胞衰老的治疗靶点。

已经证明，尽管不同的化合物激活同一目标，其效果可能因激活的性质和时间而不同。在我们的研究中，AMP模拟物AICAR对皮肤溃疡有轻微的预防作用，但不如虫草素，而二甲双胍对皮肤溃疡没有预防作用。二甲双胍激活AMPK被认为是氧化磷酸化抑制引起的代谢应激和由此导致的细胞质AMP水平升高的间接结果。相反，ZMP，活性形式的AICAR可以通过分别结合γ和β亚基直接激活AMPK，并不是依赖于细胞的能量和代谢状态。虫草素可以直接促进AMPK活性，这不是由于上游激酶的刺激，也不是通过改变AMP/ATP的比值。总之，这些观察结果表明，AMPK在放射性溃疡中的作用是复杂的，可能依赖于环境。

总之,我们的研究结果提供了一种减轻辐射溃疡的途径, 虫草素作为一种天然的NRF2激活剂，通过直接与AMPK的α1和γ1亚基在自抑制域附近结合，直接缓解自抑制，并通过阻断细胞衰老成为一种有希望的辐射溃疡缓解剂 (图9)。

图9：虫草素通过防止细胞衰老作为辐射溃疡缓解剂的模型。放射溃疡中持续的DNA损伤灶形成和衰老细胞积累，参与了放射溃疡的发展。虫草素通过与自抑制域(AID)附近的α1和γ1亚基相互作用直接结合AMPK激活AMPK，激活的AMPK促进Keap1的p62依赖的自噬降解，因此，NRF2从Keap1解离并移动到细胞核，在那里激活抗氧化基因。