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具有两个氧化还原中心的含硒醌基三唑的合成、抗肿瘤活性及其机理研究

发表于:2021-05-13   作者:Cruz E   来源:European Journal of Medicinal   点击量:

原文:Cruz E ,  Silvers M A ,  Jardim G , et al. Synthesis and antitumor activity of selenium-containing quinone-based triazoles possessing two redox centres, and their mechanistic insights[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 122:1-16.
翻译:

具有两个氧化还原中心的含硒醌基三唑的合成、抗肿瘤活性及其机理研究

1、介绍
在对抗不同类型癌症的过程中,发展多种治疗方法至关重要。醌类化合物被认为是一种特殊结构,是最重要的抗癌药物之一。尽管单靶点药物成功地抑制或激活了特定靶点,能够同时作用于多种生物靶点的药物在新药设计中更具吸引力。在这种情况下,喹诺酮类化合物是一类重要的多目标化合物。
天然萘醌类化合物,如从塔贝属植物心材中分离得到的拉帕醇和β-拉帕醇(β-lap),是研究最多的潜在抗肿瘤活性的化合物之一。Docampo等人发现β-lap在体外和S-180肿瘤的小鼠中对肉瘤180腹水肿瘤细胞(S-180细胞)有显著的活性。虽然β-lap对Yoshida肉瘤和Walker-256癌细胞的抗肿瘤作用已被研究,但其确切的作用机制直到最近才被发现。
β-拉帕醇特异性地破坏内含NADP(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)的癌细胞,而不考虑p53、caspase或细胞周期状态。虽然在临床试验中,β-lap(即ARQ 501)被错误地宣传为细胞周期检查点激活剂,但细胞死亡的主要决定因素是通过NQO1的表达。该药物不是已知多药耐药或药物泵的底物,β-lap细胞死亡不受细胞周期位置、致癌因子或促或抗凋亡因子的影响。最后,药物靶点(即,被)NQO1,一种二期致癌诱导酶‘生物活性化’,该酶也由电离辐射(IR)在一些癌细胞(但不是正常细胞)中诱导。
β-Lap作为一种化疗药物的使用由于其高疏水性而受到限制,这种疏水性导致患者高铁血红蛋白血症。当与载体羟丙基-β-环糊精混合时,载体本身有助于溶血。Ohayon和他的同事们最近阐明了β-lap对二氢喹啉酶的抑制作用是不可逆的假设。这些结果表明,β-Lap的治疗作用可能与泛素特异性肽酶2(USP2)氧化有关,这可能是通过NQO1无效循环代谢β-lap产生活性氧(ROS)的下游效应。NQO1是一个独特的基因,当被删除时,会导致对b-lap和其他NQO1生物活性药物产生耐药性,强烈表明被引入的大多数下游效应是NQO1衍生的ROS上调和细胞内Ca2+增加的结果, PARP1过度激活NAD+- Keresis引起NAD+/ATP的快速和显著损失。
在过去的几年里,我们的团队一直致力于合成和评估拉帕酮对癌细胞株的作用。我们发现了一系列具有改性C-环的拉帕醇(方案1a),它们对癌症谱系具有很强的活性。最近,我们发现了具有独特亚基的生物活性化合物,激发了人们对制备醌基三唑类化合物的兴趣。最近,Perumal等人用同样的分子杂交策略制备了具有抗细菌活性的氨基-1,4-萘醌-三唑类化合物。对MDA-MB-435癌细胞而言,β-拉帕醇基1,2,3-三唑具有显著的活性,其IC50值小于2μM。这些化合物通过一种明显的凋亡细胞死亡机制促进细胞死亡,这种机制与显著的活性氧生成有关。在1,4-萘醌中插入三唑部分的方法也很有效,因为这个单元被称为有效的药效基团。最近,1,4-萘醌基1,2,3-三唑类化合物(方案1a)在HL-60人早幼粒细胞白血病细胞中被报道具有1.4-1.9μM的高活性。

从另一个角度看,有机硒化合物具有抗肿瘤、抗菌、抗神经变性和抗病毒的特性。一系列的硒蛋白参与了重要的生理过程。Jocob和同事展示了硒仿醌(方案1b)潜在的抗肿瘤活性,其能够模仿人酶谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的酶活性。GPx靶向氧化还原敏感的硫醇蛋白,同时在临界阈值产生活性氧。因此,这些药物充当活性氧使用者和活性氧增强剂,影响下游目标。这一作用将补充β-lap的作用机制,因为该试剂引起的死亡依赖于由ROS(H2O2)刺激的PARP1的过度激活。
在继续获得新的有效抗肿瘤萘醌的项目中,根据我们小组最近报告的发现,我们发现了含有β-lap的有效查尔根(方案1b)。在这里,我们描述了15种新的含硒醌类化合物,我们的策略是插入这个药效团,生成含1,2,3-三唑硒的拉帕酮(方案1c)。所选的萘醌对几种癌细胞株具有识别活性的结构框架,用于制备新化合物。这些结构被设计成可能导致NQO1细胞死亡的多靶配体。
2、结构与讨论
2.1 化学
第一类具有两个氧化还原中心的化合物是从拉帕醇(1)中获得的含硒二氢吡喃萘醌(方案2)。以1为原料,经酸催化环合制备了α-拉帕酮2,并以2为原料合成了含硒衍生物67。化合物6,由铜(I)催化化合物4与(叠氮甲基)(苯基)硅烷的点击反应以中等产率(75%)制备。中间体4是由3-乙炔基苯胺和溴代衍生物3反应得到的。如前所述,在二氯甲烷中3与叠氮化钠反应容易合成4-叠氮-a-拉帕酮(5)。5与苯基炔丙基硒化物的反应得到含硒的α-拉帕酮1,2,3-三唑7。最后,从我们报道的叠氮化物衍生物9中,得到红色固体β-lap基1,2,3-三唑10。化合物3-10是外消旋的。然而,化合物9和10是单非对映体,相对立体化学是反式的。通过与先前报道的数据对比,证实了反式立体化学。

我们开始合成含硒二氢呋喃萘醌,这是第二类化合物,最初是通过合成nor-α-拉帕醇衍生物1516(方案3)。由于芳胺取代的拉帕酮和叠氮醌的合成在本组中已得到充分的证实,因此如方案3所示制备了化合物1314。采用点击法,化合物1314分别与含硒叠氮化物和炔烃反应,得到萘醌1516,产率分别为70%和80%。

以nor-拉帕醇(17)为原料,采用Pinto和同事描述的方法合成溴中间体18(方案4)。报道了由18而来的不同抗肿瘤化合物的合成,如芳胺基和烷氧基取代的nor-β-拉帕醇,在1,2,3-三唑基存在下的拉帕醇和硫酮的杂化物。基于先前描述的具有抗癌活性的化合物,制备了带有末端炔基的未公开发表的芳胺基取代的拉帕酮19。本文所述含硒1,2,3-三唑2119形成,使我们能够得到设计有两个氧化还原中心的产品。使用上述相同的策略,化合物22从叠氮化物衍生物20中获得,先前由我们小组报告(方案4)。

在这一点上,我们描述了从其亚同系物拉帕醇(1)和非拉帕醇(17)中获得的拉帕酮的合成。最近,我们报道了一类新的萘醌类化合物的合成,该类化合物由C-烯丙基指甲花醌(23)合成,含有1,2,3-三唑基序。23的碘化反应得到了68%的产率和1:1的比例(方案5)的化合物2427,它们很容易被柱色谱分离。在这些化合物的作用下,叠氮化钠与二甲基甲酰胺反应合成了叠氮化物衍生物,化合物2528。通过铜催化叠氮炔环加成反应制备了相应的硒衍生物化合物2629(方案5)。

1,4-萘醌与含硒的1,2,3-三唑偶联也是我们的研究课题。从化合物33-3539中,使用先前讨论的方法制备了相应的三唑衍生物,化合物36-3840(方案6)。得到了合适的化合物3538的晶体,并用晶体学方法对其结构进行了表征。

最近,我们报道了一种直接的方法来获得对映体富集的α-拉帕酮衍生物。为了鉴定新的对映体富集的抗肿瘤化合物,利用指甲花醌(41)与手性方酰胺通过有机催化制备了硝基衍生物4243(方案7)。用NiCl2.6H2O/NaBH4将醌的硝基还原为氨基,得到了氨基醌4445。由于不稳定,这些化合物在合成后立即用于在重氮转移反应后制备叠氮醌4647。在最后一步中,我们采用经典的点击法,在二氯甲烷和水的1:1混合物中,通过抗坏血酸钠和硫酸铜(II)的催化作用,与苯基丙炔硒醚反应,制备了含1,2,3-三唑4849的硫系化合物。

通过1H、13C NMR和2D NMR谱(COSY、HMBC和HSQC)测定了新化合物467101315161921222629363738404849的结构。还获得了电喷雾电离质谱,以确认化合物的特性。
2.2 生物学研究
所有含硒醌基1,2,3-三唑类化合物(方案2-7)及其合成前体均采用MTT法对六种肿瘤细胞系进行体外评价:HL-60(人早幼粒细胞白血病细胞,NQO1-)、HCT-116(人结肠癌细胞,NQO1)、PC3(人前列腺细胞,NQO1+)、SF295(人胶质母细胞瘤细胞,NQO1+),MDA-MB-435(黑色素瘤细胞,NQO1+)和OVCAR-8(人卵巢癌细胞,NQO1+)。β-拉帕酮和阿霉素作为阳性对照(表1)。NQO1-正常细胞、人外周血单个核细胞(PBMC)和小鼠成纤维细胞永生化细胞系(V79和L929)评价化合物的选择性。还使用相当特异的NQO1抑制剂双香豆素对所选化合物的NQO1-依赖性的机制方面进行了研究。如前所述,根据其活性将化合物分类为高活性(IC50<2 μM)、中等活性(2 μM<IC50<10 μM)或非活性(IC50>10 μM)。

结果表明,大多数化合物对所评价的所有癌细胞株都有很强的抗肿瘤活性,IC50值<2 μM。总的来说,邻喹诺酮类化合物比对苯二酚更为活跃。然而,还发现了具有强抗肿瘤活性的α-拉帕酮衍生物。
萘并吡喃醌5-7910具有高到中等的活性(IC50在0.92-5.46μM范围内),非活性化合物4是这类化合物的例外。对于含硒醌610,插入第二氧化还原中心的策略是成功的,并且这些衍生物比其萘醌前体更为活跃。对于含硒醌610,插入第二氧化还原中心的策略是成功的,并且这些衍生物比其萘醌前体更为活跃。近年来,我们报道了几种α-拉帕酮基1,2,3-三唑类化合物的合成及其抗肿瘤活性。值得注意的是,含硒的1,2,3-三唑7比不含硫键的化合物表现出更好的活性。
萘呋喃醌是第二类化合物。对萘醌1516对所研究的所有癌细胞株都有活性。在过去的几年中,我们描述了从lapachol(1)中获得的非α-lapachone基1,2,3-三唑,其IC50值大于2μM。本文中用于在硒存在下制备化合物1516的策略提高了基于nor-α-lapachone的1,2,3-三唑类化合物的活性,并且这些衍生物的IC50值在0.68-1.71μM(15)和1.59-2.95μM(16)。
Nor-β-lapachone及其衍生物是来自lapachol基团的最有效的化合物之一。最近,我们还展示了Nor-β-lapachone在人淋巴细胞、HL-60白血病和永生正常小鼠V79成纤维细胞中的细胞毒性和遗传毒性,其范围为2.5~5μM。该化合物未能诱导非肿瘤细胞DNA损伤,但在最高浓度下,它诱导DNA单链和双链断裂,增加染色体畸变的频率。它的生物学效应与其消耗谷胱甘肽(GSH)的能力有关,它导致了一种亲细胞的亲氧化细胞状态,从而促进了它的抗增殖特性。
在此背景下,我们描述了nor-β-lapachones的有效抗肿瘤活性。重要的是,C-环修饰的,带有芳胺基的nor-β-lapachones是所描述的最活跃的lapachones。这些化合物在人髓系白血病细胞系中具有显著的抗增殖作用,并通过ROS产生氧化性DNA损伤。它们也以某种方式损害DNA修复活性,同时引发细胞死亡,这可能是细胞凋亡。化合物21是根据先前使用这些生物活性拉帕酮的经验设计的。该化合物包含先前报道的3-芳胺基-nor-β-拉帕酮衍生物的结构框架,但通过点击化学反应插入了第二个氧化还原硫族中心。这种物质对所有被评估的癌细胞系都具有高度的活性,IC50值在0.07到0.38μM之间。此外,化合物21具有高选择性指数(SI表示为正常细胞和不同的癌细胞株之间的细胞毒性比率)。例如,PBMC vs HL-60=19.8。相比之下,阿霉素,一种临床上用于治疗各种癌症的标准药物,其选择性指数值为10.6。同样,化合物22(IC50在1.06-2.56μM范围内)比不含硫族原子的nor-β-lapachone基1,2,3-三唑更具活性。本文报道了成功制备具有两个氧化还原中心的强抗肿瘤醌的两个重要实例。化合物26,另一种从胼胝酰指甲花醌(23)中获得的nor-lapachone衍生物,也表现出很强的抗肿瘤活性。这种药物被认为是高度活跃的,其IC50值在0.07到0.29μM之间,表明其具有高度活跃的结构。化合物2126具有类似的抗肿瘤活性,显示了正萘氟烷醌部分和三唑硒基团的重要性,它们可能在相同两个氧化还原中心结构中协同工作。
还评估了1,4-萘醌36-40,这些化合物被认为是中等活性的,但化合物40对所检测的所有癌细胞都不起作用。最后评估的化合物是不对称的a-拉帕酮4849,这些物质是不活跃的。正如我们最近所描述的,不对称的a-拉帕酮衍生物对所评估的几种癌细胞系无效。在此,我们试图通过在这些醌类化合物中插入硫的方法来提高它们的活性,但这一策略失败了。表2总结了最活跃化合物的选择性指数。
我们实验室先前的研究表明,化合物50-53(图1)可被视为具有对抗多种癌细胞的有效抗肿瘤活性的原型。为了加深我们对化合物50-53作用机理的认识,并将先前报道的结构与含硒的拉帕酮为基础的1,2,3-三唑类化合物进行比较,我们用设定的2小时暴露研究其潜在的NQO1依赖性细胞毒性,有或没有NQO1抑制剂二糖醇。与相关正常组织相比,这种暴露利用了大多数实体癌中NQO1水平的升高。在含硒醌类化合物中,我们选择了化合物2122,以通过NQO1依赖机制评估其特性。

NQO1依赖性评估。在所测试的药物浓度范围内,该化合物对人肺腺癌A549(肺泡基底上皮细胞系)有活性。这些细胞表达高水平的NQO1(3000+300个酶单位)。由于添加了双香豆素(DIC,一种NQO1抑制剂),许多受试化合物的细胞死亡是NQO1特异性的。根据存活曲线(图2),先前报道的芳胺取代的nor-β-lapachone预测了IC50如下,化合物:50=2.6μM,51=1.8μM,52=2.4μM和53=1.3μM。化合物53在狭窄的治疗窗口内显示出最显著的杀伤力,从0.8μM的93%存活率上升到1.6μM的11%。总的来说,化合物50-53是NQO1特异性药物,其IC50值与β-拉帕酮相似或更低。化合物2122,含硒醌,其IC50值分别为0.64和1.2μM,是该系列中最活跃的,并且具有NQO1依赖性(表3)。他们展示了巨大的治疗窗口,使用DIC治疗作为对NQO1细胞反应的替代物,如对几乎所有人类正常组织的治疗。这些反应是NQO1依赖性的无效的氧化还原循环,这些药物产生大量的活性氧,特别是H2O2,最终导致PARP1过度活化和程序性坏死。

磷脂酰丝氨酸的外化被认为是细胞凋亡过程中的一个重要标志。经处理后,所选化合物2122诱导细胞表面表达磷脂酰丝氨酸的PC3细胞数量显著增加(图3)。另一方面,在2122暴露前用NAC预处理的培养物或与双香豆素联合处理的培养物中未观察到磷脂酰丝氨酸外化(图3)。我们的数据表明,测试化合物的细胞毒性机制可能涉及醌还原酶NQO1的药物生物还原,以及强调ROS对细胞毒性的贡献,这表明受试化合物诱导的细胞凋亡与ROS产生相关。最后,证实了这些研究,我们观察到化合物21短时间暴露(1h)导致细胞内ROS的产生。另一方面,在用NAC预暴露的培养物中,化合物21不能产生ROS,这可以通过NAC行使的抗氧化保护来解释。
3、结论
通过将两个氧化还原中心、一个喹诺酮类部分和硒原子连接起来的策略,我们制备并评价了新的和多种含硒的醌基1,2,3-三唑化合物对正常细胞系的抗癌活性。我们评估了这些药物的总体杀伤力(表1)以及NQO1的具体作用。总的来说,我们的方法是有效的,并且我们鉴定了IC50值低于0.3 μM的化合物,这些化合物比β-拉帕酮或阿霉素(一种用于治疗几种癌症的标准临床药物)更有效。我们还研究了另外两种活性化合物2122的功效,发现它们被NQO1特异性地生物活性化,比我们之前发表的nor-β-lapachone具有更高的效价。有趣的是,我们发现,这些药物中含有谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)样活性,所选择的硒含有nor-β-拉帕酮基1,2,3-三唑,是最有效的,并且在这两个靶标上起作用。Annexin V细胞计数分析也被用于可视化化合物2122的活细胞、早细胞和晚期凋亡阶段的细胞群。2122的细胞毒性机制与ROS对细胞毒性的贡献本质上相关,提示凋亡与ROS产生有关。在此基础上,我们描述了不同种类的醌类、邻喹啉类和对苯二酚类化合物的抗肿瘤活性。例如,化合物29(对苯二酚)在所评估的癌细胞系中具有0.62-2.42μM范围内的IC50。以化合物10212226为例,邻醌的IC50在0.07-2.52μM之间。最后,我们已经描述了有效的抗肿瘤萘醌化合物,这些化合物作为治疗过度表达NQO1的癌症的有希望的分子出现。
本文由福山生物整理翻译,转载请注明出处。

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