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调控NRF2用于治疗疾病:时机就是一切

发表于:2019-11-05   作者:Matthew Dodson   来源:Annual Review   点击量:

关键词

癌症,临床试验,疾病,KEAP1,NRF2,治疗学
 
摘要

转录因子核因子红系2(NF-E2)相关因子2(NRF2)是氧化还原、代谢和蛋白质稳态的中枢调节因子,在多种信号级联放大通路中存在。尽管对NRF2信号复杂性的理解不断加深,但临床上只有一种作用于NRF2的治疗药物,富马酸二甲酯,用于治疗多发性硬化症。关于新疗法的发现令人困惑的是,NRF2水平的变化很大程度上取决于生理和病理环境。因此,正确定时和有针对性地操纵NRF2通路对于创建有效的治疗方案至关重要。本文总结了NRF2的调节和其下游靶点。此外,我们还讨论了NRF2在癌症、神经退行性病变、糖尿病以及心血管、肾脏和肝脏疾病中的作用,特别强调了基于NFR2的治疗方法,包括那些已进入临床试验的方法。
 
引言

转录因子核因子红系2(NF-E2)相关因子2(NRF2)最初被认为是氧化还原稳态的主要调节因子,但它还是多组细胞功能的关键中介。通过对新的调节因子、靶基因和疾病背景的持续鉴定,已经表明NRF2不仅在氧化还原稳态中起作用,而且在药物/异生物质代谢,DNA修复,线粒体功能,铁、脂类和碳水化合物代谢,蛋白质平衡和增殖中也起作用,所有这些作用都有助于细胞存活(1)。尽管已确定NRF2的益处,但仔细调节NRF2途径对疾病预防的极端重要性日渐清晰。由于详细的机理研究揭示了NRF2生理学和病理学之间的复杂相互作用,对依赖上下游调节NRF2信号级联通路的新化合物的需求不断增长。
由于新的研究揭示了NRF2信号网络之前未被重视的复杂性,基于NRF2的疗法不断出现;然而,疗法从实验室到临床的进展仍然滞后。除此之外,NRF2直接或间接发挥作用的病理环境数量正在迅速增加。本综述总结了目前已确定的NRF2的调节子和下游靶点,与其他信号通路的相互作用,以及在癌症和其他疾病中的作用。本综述还强调了目前已经发展到临床阶段的疗法,以及其他可以发展成治疗和预防疾病的NRF2药理学调节剂。
 
NRF2信号通路综述
NRF2领域的关键发现:历史视角
对NRF2的研究相对较新,大部分关键发现都发生在过去的40年中(图1)。尽管NRF2于1994年首次被克隆,但抗氧化反应的转录控制的最初概念出现在20世纪70年代,当时数项研究表明,酚类抗氧化剂的抗癌作用源于增加II相解毒酶的活化,例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(2, 3)。虽然当时还不清楚GST是否由NRF2调控,但这首先证明解毒活性中间产物的酶的激活可用于预防化学致癌作用,这些酶中许多现已被确定为NRF2转录靶点。1989年发现了一种蛋白质NF-E2,其结合的保守序列包含激活蛋白1(AP-1)的核心模体(4)。NF-E2是6种哺乳动物cap’n’collar转录因子(碱性亮氨酸拉链转录因子)中的第一种被发现与此模体结合的转录因子,该模体与其他因子NRF1(5)、NRF2(6)、NRF3(7)、Bach1(8)和Bach2(9)的结合相继被鉴定。之后在大鼠GST-Ya基因的启动子中鉴定出该NF-E2/AP-1序列,并响应叔丁基对苯二酚(t-bhq),由此产生了术语抗氧化剂反应元件(ARE)(10)。随后发现大量的巯基反应性化学物可诱导ARE驱动的基因表达,提示II相解毒酶的转录对亲电试剂(11)敏感,这是目前许多已鉴定的NRF2活化剂的一个关键功能特征。
20世纪90年代中期到后期进行了许多研究,详细描述了驱动NRF2信号传导的分子相互作用,并表征了NRF2的结构域(12)。结果表明NRF2与smallMAF(sMAF)蛋白二聚,激活含ARE元件基因的转录(13),并确定Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)(14)在蛋白质水平上对NRF2进行负向调节。此外,第一只NRF2−/−小鼠诞生且正常发育(15),但在其肠道和肝脏中的GST和NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO1)水平与服用酚类抗氧化剂(13)后的野生型小鼠相比显著降低。此外,NRF2−/−小鼠在证明NRF2在化学预防中起直接作用至关重要,因为在NRF2−/−小鼠(16)中,奥替普拉(Oltipraz,一种二硫杂环戊硫酮)的化学保护作用丢失。
一旦NRF2的化学保护作用被提出,该领域就转向了识别激活NRF2通路的方法。由于重要II相解毒酶的许多激动剂都是亲电试剂,因此NRF2的氧化还原敏感性被认为是由能够感知氧化/亲电应激的调控子赋予。2002年体外实验表明,KEAP1通过特定的半胱氨酸残基感知亲电应激,同时将亲电诱导剂加和至巯基,破坏了KEAP1-NRF2相互作用(17)。一年后,在细胞中发现不同的KEAP1半胱氨酸对不同的诱导物敏感,这一概念被称为半胱氨酸代码(18)。与此同时,研究表明,KEAP1招募了Cullin 3环盒1(CUL3-RBX1)E3泛素连接酶复合物,靶向泛素化NRF2的7个关键赖氨酸残基,降解NRF2(19,20)。不久之后,人们发现糖原合成酶激酶β(GSK3-β)磷酸化NRF2关键残基是一种不依赖KEAP1降解NRF2的途径,其触发了S相激酶结合蛋白1-Cullin1-Rbx1/β-转导素重复序列包含蛋白(SCF/β-TrCP)E3连接酶复合物(21,22)的募集。
2006年发现KEAP1在非小细胞肺癌中发生突变并导致NRF2水平长期升高,首次证明NRF2可能有助于癌症进展和耐药性,后来被称为NRF2的黑暗面(23,24)。这导致了研究高NRF2表达在癌症中作用的领域发生了转变,而抑制NRF2可能是治疗某些癌症的前提。另一个与NRF2黑暗面相关的里程碑性发现是自噬功能障碍引起p62依赖性的KEAP1隔离,导致NRF2以一种非正常、不依赖半胱氨酸的方式长时间激活(25,26)。随着NRF2研究领域的不断扩大,我们对这条通路复杂性的理解也在不断推进。


 
 
图1 在过去40年中,在NRF2研究领域的关键发现。缩写:ARE,抗氧化反应元件;ER,内质网。
 
负调节子和激活NRF2的模式

NRF2的调节主要通过控制维持NRF2蛋白水平来实现。三种E3泛素连接酶复合物负责NRF2、CUL3-RBX1-KEAP1复合物、SCF/β-TrCP复合物和HRD1复合物的泛素化和降解。每一种E3泛素连接酶复合物都能在特定亚细胞间室内的不同刺激下调控NRF2的降解。细胞质基质中的CUL3-RBX1-KEAP1复合物响应亲电/氧化应激。细胞核或细胞质基质中的SCF/β-TrCP复合物对代谢变化更敏感,由GSK3-β调节。HRD1定位于内质网(ER),并且被证实仅在ER应激期间泛素化NRF2(27)。值得注意的是,其他信号通路、表观遗传因子和翻译后修饰(PTMs)也同样调节NRF2。此外,通过靶向NRF2的负调控可以实现NRF2通路的激活或抑制(图2)。


 
 
图2 NRF2的调节和可能激活模式的示意图。NRF2在转录后和翻译后水平以及通过表观遗传因子和与其他信号通路的相互作用进行调节。NRF2蛋白水平的调节可以通过激活或抑制CUL3-RBX1-KEAP1复合物、SCF/β-TrCP复合物或HRD1来实现。关键半胱氨酸的亲电/氧化修饰、含ETGE的蛋白质的竞争性结合、蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂、p62/SQSTM1、mTOR抑制剂和CUL环E3连接酶抑制剂(例如MLN4924)的水平升高都可能破坏KEAP1-NRF2相互作用。KEAP1启动子的高甲基化也可以增加NRF2的表达。SCF/β-TrCP-NRF2相互作用可通过胰岛素/生长因子或GSK3-β、CUL环E3连接酶、PI3K-AKT-PKC、mTOR、ERK/p38 MAPK和WNT抑制剂进行调节。HRD1抑制剂(例如LS-102)可用于防止NRF2内质网应激相关降解。缩写:ER,内质网;ROS,活性氧。
 
NRF2靶基因

目前已经鉴定出超过250个NRF2靶基因,其参与了多种细胞过程,包括氧化还原调节、I-III相药物/异生物质代谢、蛋白质稳态、DNA修复、碳水化合物和脂质代谢、铁稳态、转录调节和线粒体功能(图3)。


 
 
图3 由Nrf2靶基因驱动的细胞通路。NRF2与sMAF蛋白异二聚体化,启动含抗氧化反应元件靶基因的转录。已证实的NRF2靶基因参与了蛋白酶体组装、自噬、防止细胞凋亡、维持氧化还原平衡、脂质和碳水化合物代谢、血红素代谢、铁稳态、药物/异生物质代谢的所有三相、其他转录因子的转录调节和DNA修复。代表性靶基因包含在每个转录应答下面的括号中。缩写:GSH,谷胱甘肽。
 
氧化还原调控。也许最著名的功能是维持氧化还原平衡,主要是通过谷胱甘肽和基于巯基抗氧化酶的合成和氧化还原循环。例如,负责谷胱甘肽(GSH)从头合成的谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCL)的催化和调节亚单位(GCLC和GCLM)是NRF2靶基因。此外,利用谷胱甘肽减少过氧化物的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX2和GPX4)、减少氧化态谷胱甘肽的谷胱甘还原酶(GSR)和直接减少过氧化物的过氧氧化还原蛋白(PRDX1和PRDX6)均是NRF2靶基因(28)。通过硫氧还蛋白1和硫氧还蛋白还原酶1(TXN1和TXNRD1)的协同作用减少氧化的蛋白巯基,与通过xCT转运体(SLC7A11)导入对谷胱甘肽产生至关重要的半胱氨酸,也都由NRF2转录调节(28)。
 
药物/异生物质代谢。NRF2调节药物/异生物质代谢的所有三相。参与I相代谢的NRF2靶点的例子是醛酮还原酶家族成员(例如AKR1C1、AKR1B1和ARK1B10)(29)、醛脱氢酶家族成员(例如ALDH1A1、ALDH3A1和ALDH7A1)(30)和NQO1(13),这些酶都参与将毒物/药物还原为活性代谢物。这使得包括GSTs(例如GSTA1-4和GSTM1-4)(31)和UDP葡萄糖醛酸转移酶(例如UGT1A1和UGT2B7)(32,33)在内的II相NRF2转录靶点分别与GSH或葡萄糖醛酸结合。最后,NRF2还调节III相膜转运蛋白(ATP结合盒家族成员/多药耐药蛋白,例如ABCC1–5和ABCG2)(34,35)的转录,而这些转运蛋白将异生物质/药物从细胞中排出。
 
蛋白质稳态。NRF2下游基因通过自噬和泛素-蛋白酶体系统参与维持蛋白稳态。最近发现一些自噬起始蛋白,包括自噬相关(ATG)5和7,以及unc-51样自噬激活激酶(ULK)1和2,被认定含有AREs(36)。NRF2可直接调节蛋白质翻译和自噬的主调节子mTOR(37)。此外,p62/SQSTM1作为一种以泛素化蛋白质为靶点进行自噬降解的蛋白质,也是NRF2靶点。NRF2还控制蛋白酶体亚单位[例如蛋白酶体亚单位α1(PSMA1)和蛋白酶体亚单位β5(PSMB5)](38)以及蛋白酶体成熟蛋白(POMP)(39)的表达,其对蛋白酶体组装至关重要。
 
脂质、碳水化合物和铁代谢。NRF2调节多种葡萄糖和脂肪酸合成代谢所必需的代谢酶。戊糖磷酸途径酶,包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)和转醛酶(TALDO1),在NADPH再生过程中起着关键作用,且均为NRF2靶基因(40)。NRF2还调节苹果酸酶(ME1)和异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)这两种关键三羧酸循环酶的表达(40,41)。脂类分解代谢受NRF2调控,脂肪酶H(LIPH)、磷脂酶A2(PLA2G7)和乙酰辅酶A氧化酶2(ACOX2)(42)均是NRF2的靶点。最后,NRF2通过转录血红素加氧酶1(HMOX1)、胆绿素A和B(BLVRA/B)以及铁蛋白轻链和重链(FTH1/FLH1)(43)调节血红素代谢和铁稳态。
 
转录调控、DNA修复和阻止凋亡。数种转录因子的启动子内已经鉴定出ARE功能区,包括芳基烃受体(AhR)、神经源性位点Notch同系物蛋白1(Notch1)和视网膜受体α(RXRA),这表明NRF2可以间接控制许多不含ARE的基因的转录,以下详述。NRF2也在DNA损伤修复和阻止凋亡中发挥作用,因为p53结合蛋白1(53BP1)、DNA修复蛋白Rad51同系物1(RAD51)(44)、抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2(BCL2)和B细胞淋巴瘤特大(BCLXL)(45,46)由NRF2转录调节。NRF2靶点的多样性表明了NRF2在调节细胞功能中的中心作用。
 
 
与其他信号通路的串扰

尽管NRF2通过其转录靶点直接调节许多细胞反应,但其也可通过与其他主要信号级联通路的串扰来调节细胞功能。这些通路对应激反应至关重要,包括Notch1、AhR、核因子-κB(NF-κB)、细胞肿瘤抗原p53(p53)、AMP活化蛋白激酶(AMPK)、PI3K-AKT和mTOR,突显了NRF2在维持细胞存活中的关键作用。

Notch信号通路介导胚胎发育过程中的细胞周期和凋亡以及决定细胞命运。NOTCH1基因在其启动子的近端区域具有ARE功能区,并且Notch信号在NRF2−/−小鼠胚胎成纤维细胞中减弱(47)。NRF2-NOTCH信号轴在肝脏再生过程中至关重要,因为部分肝切除后的NRF2−/−小鼠与野生型小鼠相比肝再生延迟;然而,将这些小鼠与过度表达NOTCH胞内结构域(NICD)的小鼠杂交,完全挽救了NRF2无表型小鼠(47)。相反,NRF2可以通过NOTCH调节,因为在动物的NRF2启动子区域中,典型NOTCH转录所需的RBPjκ序列高度保守。此外,NICD过表达小鼠的NRF2过度活化,表现出与肝特异性KEAP1−/−小鼠非常相似的表型(48)。因此,NRF2和NOTCH之间的相互作用似乎在介导细胞保护,特别是在肝再生的方面起不可或缺的作用。

NRF2信号也与对外源性应激反应的通路重叠。例如,与芳基烃受体核转运体形成复合物的AhR,可以被多环芳烃(例如二恶英)结合,并从胞质溶胶转移到细胞核,以调节含异生物质反应元件(XRE)基因的转录(49)。NRF2及其一些靶基因,如 GST (50)和NQO1(51),也含有XRE。此外,研究还表明,NRF2可以通过ARE(52)直接调控AhR转录,也可以通过巴多酮-咪唑内酯(CDDO-Im;合成,三萜类)的诱导调控AhR靶基因转录(53)。

另一个与NRF2双向相关的主要通路是NF-κB途径。现已证明,NF-κB抑制了含有AREs基因的转录,因为NRF2和p65/RelA(一种NF-κB转录复合物的组成部分)都需要CREB结合蛋白(CBP)来转录各自的靶基因(54)。因此,如果p65与CBP结合,会阻止由NRF2驱动的ARE转录。有趣的是,几种NRF2活化剂,包括萝卜硫素(SF)(55)、甲基巴多酮(CDDO-Me)(56)和姜黄素(57),已被证明能够抑制NF-κB信号传导。相反,与野生型小鼠相比,NRF2−/−小鼠在促炎刺激后表现出更多的NF-κB活化迹象(58)。NF-κB激酶β亚单位(IKKβ)的抑制剂作为一种公认的NF-κB负调节因子,已证明被CUL3-RBX1-KEAP1复合物(59)泛素化和降解。最后,几个NRF2靶基因,如NQO1、TRX1和HMOX1,已经被证明可调控NF-κB驱动的转录,这表明这些通路在上下游水平(60)发生交叉。

NRF2直接与p53/p21级联相互作用,而p53/p21级联是抗癌治疗的重要靶点,其调节细胞凋亡。具体来说,NRF2和p53的共表达导致多种细胞系(61)中SLC7A11、NQO1和GST的抑制。研究表明,NRF2可以调控p53的负调节因子E3泛素蛋白连接酶MDM2的表达,表明NRF2可以直接调控p53的活性(62)。此外,p21(CDKN1A),一种参与细胞周期、凋亡和分化调节的p53靶基因,直接与NRF2的DLG和ETGE模体结合,从而稳定和转录含ARE的基因(63)。NRF2和p53之间的相互作用被以下事实进一步证明,即NRF2−/−;p53+/−小鼠比其NRF2−/−或p53+/−小鼠(64)更容易受到亚硝胺诱导的致癌作用,其表明NRF2和p53在介导应激期细胞生存方面至关重要。
NRF2也与对新陈代谢变化作出反应的关键通路相互作用。例如,AMPK,一种通过AMP:ATP比率来检测细胞整体能量状态的传感器,磷酸化NRF2的S550处,增强其核易位(65)。同样地,β-TRCP降解NRF2所必需的GSK3-β可被PI3K-AKT信号轴(66)或mTOR(67)磷酸化,这表明NRF2的稳定性可以由这两个通路决定。也有研究表明,mTOR磷酸化p62/SQSTM1,增强其与KEAP1的相互作用,导致p62-KEAP1复合物的自噬降解和NRF2的上调(68)。总的来说,NRF2与数个决定了细胞生长和存活的关键信号级联相互作用。
 
NRF2调节的其他模式
NRF2信号通路的表观遗传控制,以及影响NRF2表达的KEAP1和NRF2/NFE2l2中几个单核苷酸多态性,已在癌症背景下被广泛研究。启动子甲基化调节NRF2和KEAP1,以及几个NRF2靶基因的表达,包括GST、NQO1、GPX和UGT1A1(69)。化疗可以降低NRF2启动子的甲基化,例如在耐药结肠癌中5-氟尿嘧啶(5-FU)可诱导活性氧物种(ROS)生成,导致NRF2启动子的低甲基化,升高NRF2水平(70)。NRF2活性可受KEAP1启动子的高甲基化影响,导致NRF2的表达增加。并不是所有的表观遗传修饰都能增强NRF2的活性,例如晚期前列腺癌中NRF2启动子的高甲基化抑制NRF2(71)。组蛋白的乙酰化/去乙酰化和甲基化/去甲基化,以及microRNAs,也被证明影响NRF2的激活(69)。需要更多的研究来确定潜在表观遗传靶点来调节疾病中的NRF2通路。
除了泛素化和磷酸化NRF2的Neh2和Neh6结构域中关键残基调控其稳定性外,NRF2还可以通过其他几种PTMs(post-translational modifications,翻译后修饰)进行修饰,包括甲基化、乙酰化和类泛素化修饰。通过p300/CBP乙酰化Neh1结构域的关键赖氨酸残基增强其DNA结合能力,可提高NRF2的活性,且去乙酰化(72)能逆转。NRF2在R437位点上的甲基化也影响其转录活性(73)。如前所述,NRF2的磷酸化导致其降解;然而,其他丝氨酸残基(s40、s215、s408、s550和s577)也可被数种上游激酶磷酸化(65、74、75)。尽管NRF2转录活性的影响可能取决于激酶/丝氨酸组合,但这些丝氨酸残基的磷酸化被认为增加了NRF2向细胞核的易位。另一种确认的NRF2的PTMs是类泛素化修饰,它增强了HepG2细胞(76)中NRF2的泛素化和降解,而在胰腺β-胰岛细胞中,它增强了NRF2活性并促进了细胞存活(77),表明了NRF2的PTMs的细胞类型-特异性相关性。
 
靶向NRF2用于疾病
调控NRF2预防和治疗癌症和其他慢性疾病
在NRF2研究领域有一个正在发展的主题,即疾病条件下依赖于环境和时间的靶向NRF2。利用药物活化NRF2的有益作用仍然是基于NRF2化学预防和干预其他慢性疾病的一个重要方面,如神经退行性病变、糖尿病、心血管疾病以及慢性肾脏和肝脏疾病。然而,越来越多的研究表明,在某些癌症和疾病阶段,NRF2水平已经很高,这表明也应考虑设计减轻与延长NRF2活化相关的潜在有害或转化效应的药物。图4总结了当前NRF2活化剂和抑制剂以及疾病中NRF2表达水平的示例。


 
 
图4 NRF2活化剂/抑制剂以及基于癌症和其他慢性疾病中NRF2水平的当前治疗方案。在疾病中靶向NRF2依赖于时间和表达水平。几种NRF2活化剂和抑制剂已被鉴定可用于转化治疗。成为临床试验的疗法被突出显示(星号)。DMF(Tecfidera;bold)是该组中唯一一种FDA批准的药物。NRF2水平和治疗可能性随疾病时间和阶段而异。在癌症启动期或神经退行性或慢性炎症疾病发作之前,NRF2激动剂被认为提供了最大的治疗益处。一些疾病,如糖尿病、心血管疾病、前列腺癌、炎症性疾病和启动后阶段/早期癌症,根据具体情况,已报告具有低或高水平的NRF2。发病后的治疗选项以NRF2为靶点,以干预和预防或延缓病情发展。许多癌症类型表现出高水平的组成性NRF2。对于高水平的NRF2具有有害作用的疾病,NRF2抑制剂或辅助方法将是最有效的。癌症和晚期高水平NRF2的疾病通常与预后不良有关,在这一阶段的治疗旨在减轻症状和提高其他疗法的疗效。缩写:ATRA,全反式维甲酸;D3T,3H-1,2-二硫杂茂-3-硫酮;DMF,富马酸二甲酯;FDA,美国食品药品监督管理局;t-BHQ,叔丁基对苯二酚。
 
NRF2用于化学预防。迄今为止,已有数百项研究评估了激活NRF2的化合物(78,79)的体外和体内化学预防性能。重要的是,大多数化学预防化合物(或其生物活性代谢物)是亲电试剂,并通过对半胱氨酸的修饰激活NRF2,尽管结合KEAP1的Kelch结构域的肽和小分子也已被开发(80)。迄今为止,萝卜硫素(天然,异硫氰酸酯)、CDDO-Me(合成,三萜类)、RTA 408(合成,三萜类,奥马维洛酮)和富马酸二甲酯(DMF;合成,Tecfidera)是仅有的进入美国临床试验的NRF2活化剂,只有Tecfidera被批准用于治疗多发性硬化症(MS)。显然,基于NRF2的安全、有效和特定疗法的发展仍然是癌症预防的一个探索领域。然而,关于使用NRF2活化剂可能促进NRF2黑暗面并支持先前存在肿瘤的进展,这一点仍存在争议。因此,根据NRF2水平和癌症分期,目标人群和给药方案应非常仔细地定时和规划。
 
组成性NRF2在癌症中的激活。考虑到NRF2的生存优势,癌细胞劫持NRF2通路并不奇怪。Kelch或KEAP1介导区域的突变降低了其与NRF2的相互作用,导致肺癌细胞系和组织的组成性活化(81)。此外,KEAP1中的一些体细胞突变以及野生型等位基因杂合子的丢失,提高了NRF2水平并产生了耐药性(23)。重要的是,研究证实,在肺腺癌中,KEAP1的突变频率与TP53相同,而在肺鳞癌中,KEAP1和NRF2是突变频率最高的基因(82,83)。据癌症基因组图谱项目报告,超过30 %的鳞状细胞癌病例(84例)中KEAP1与NRF2发生突变和拷贝数改变,以及CUL3的缺失或突变。研究还发现,由于CUL3缺失或启动子甲基化,RBX1的表达降低(85,86)。表1总结了导致NRF2组成性激活的机制以及观察到的癌症类型。
 
表1 NRF2通路基因的遗传改变导致NRF2高表达和其所对应的肿瘤类型。


 
 
缩写:CNV,拷贝数变异;LOH,杂合子丢失
 
NRF2抑制剂在克服癌症抵抗中的作用。从天然产物提取物的筛选结果中发现了第一种NRF2抑制剂,Brusatol(天然,类西林类)(105)。Brusatol通过降低NRF2及其靶基因的蛋白质水平,使一些癌细胞系对化疗药物敏感(105)。在异种瘤移植模型中,Brusatol与顺铂联合使用可提高肺癌细胞的化疗敏感性,在小鼠肺癌模型(LSL-KrasG12D/+)(105)中提高了肿瘤总负荷。尽管最近的两份出版物已经确定了Brusatol是一种全局翻译抑制剂(106,107),但它仍是研究NRF2在癌症化学增敏中的抑制作用的有用工具,因为诸如NRF2等短寿命蛋白最容易受到蛋白质翻译抑制。氟哌酮(人工合成,生物碱)也已被证明通过抑制全局蛋白质翻译使依赖于氟哌酮的癌细胞对抗癌药物敏感(108)。
其他的NRF2抑制剂包括:ARE表达调节剂1(AEM1),一种具有未知作用机制的小分子抑制剂(109),和ML385,一种结合到NRF2的Neh1结构域的分子,阻止NRF2同MAFG二聚与结合ARE的过程(110)。ML385是目前最有趣的抑制剂,但它有一个意料之外的作用,即导致NRF2的mRNA和蛋白质水平呈剂量和时间依赖性的显著下降。这种下降不太可能是直接抑制与ARE的结合,因此需要进一步调查。没有精确定义作用模式的负向调节NRF2活性的其他天然产物包括:甘露酮(111)、马拉巴尼酮A(112)、赭曲霉素A(113)和沃戈宁(114)。此外,由于核受体可直接结合NRF2并抑制其激活活性,一些研究提出地塞米松/布地奈德(糖皮质激素受体激动剂)和全反式维甲酸(ATRA;维甲酸受体激动剂)作为NRF2抑制剂(115)。然而,这些化合物的主要靶点是核受体而不是特定的NRF2,因此这些靶点不太可能作为NRF2靶点疗法开发。
 
神经退行性病变中的NRF2。与癌症相似,NRF2在神经退行性疾病中的作用是复杂的。有趣的是,NRF2的表达减少与神经干细胞功能(116)随年龄相关下降有关,并且NRF2对氧化应激的反应也随着年龄增长而降低(117)。在神经退行性病变过程中,NRF2可以被激活或抑制,这取决于受影响的细胞类型和疾病的阶段。例如,一些研究表明,在阿尔茨海默病(AD)患者的大脑中,NQO1和HMOX1减少,而另一些研究表明,NRF2仍然局限于细胞质基质,导致靶基因表达降低(118)。在活动的巨噬细胞和星形胶质细胞中,NRF2和NQO1表达升高,但在非活动的巨噬细胞和星形胶质细胞以及MS病变中,NQO1、HMOX1和PRDX水平持续升高,并且在帕金森病(PD)患者的黑质中观察到NRF2的核定位(118)。相反,肌萎缩侧索硬化患者的初级运动皮层和脊髓中的NRF2蛋白水平降低(119)。这些差异可能是特定于细胞类型和大脑区域的,但也可能是由于所调查疾病阶段的结果。由于NRF2通路的反应性随着年龄增长而降低,NRF2可能在疾病早期激活,在疾病后期下降。
一些NRF2的药理活性剂改善神经退行性表型。巴多酮甲酰胺(合成,三萜类,CDDO-MA)已被证明能改善转基因AD小鼠的记忆,减少淀粉样β斑块的形成(120)。同样,葛根素(天然,植物雌激素)、萝卜硫素、荭草苷(天然,黄酮)和黄芩苷(天然,黄酮)改善了AD表型(121-124)。3H-1,2-二硫醇-3-硫酮(天然,二硫杂茂硫酮,D3T)和巴多酮乙酰胺/三氟乙酰胺(合成,三萜类,CDDO-EA/TFEA)可保护野生型小鼠,但不保护NRF2−/−小鼠和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的PD小鼠(125,126)。DMF是目前唯一通过三期临床试验治疗多发性硬化症的NRF2激动剂;然而,最近使用萝卜硫素、CDDO-TFEA和苦参碱(天然生物碱)的研究显示,它们恶化小鼠表型(127-129)。令人好奇的是,DMF是该组中唯一一种获得美国食品药品监督管理局批准的药物,尽管它不是最有效的NRF2激动剂,这可能是由于NRF2不依赖于免疫调节(130)、与其他途径的协同作用,或者NRF2激活的程度取决于疾病背景。
 
NRF2在糖尿病中的双重作用。在I型和II型糖尿病中也证实了NRF2的失调。氧化应激增加是糖尿病的一个普遍特征,它导致许多组织的细胞功能障碍和代谢变化。然而,与癌症和神经退行性病变中的NRF2相似,NRF2在糖尿病中作用复杂,其取决于组织和细胞类型。在链脲佐菌素诱导的I型糖尿病(131)小鼠模型中,SF和肉桂醛(CA,天然,黄酮)均能抑制氧化损伤并恢复正常肾功能。口服CDDO-Im可增强db/db小鼠的NRF2活性,降低糖尿病表型(132)。CDDO-Im、CDDO-Me、奥替普拉和姜黄素改善了遗传性与高脂肪饮食诱导的糖尿病2种模型(133-136)中的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性。
有趣的是,具有较高NRF2组成水平的KEAP1flox/−小鼠与db/db小鼠(132)杂交时,也表现出延迟糖尿病发作;然而,其他研究表明,KEAP1基因敲除增强了Lepob/ob小鼠和高脂肪饮食(137,138)小鼠的糖尿病表型,这表明饮食和遗传因素导致了糖尿病的发生。控制NRF2可能对糖尿病的发病和进展有不同的影响。CDDo-Me被证明能增强糖尿病肾病患者的肾功能并减轻其体重(139);然而,由于心血管事件的风险增加,该研究被终止。重要的是,改进特异性和适当的临床环境仍然可以为这类和其他基于NRF2药物(140)产生积极的结果。
 
NRF2在心血管、肾脏和肝脏疾病中的作用。心血管疾病包括从高血压到冠状动脉疾病的各种疾病。与其他慢性疾病一样,许多心血管疾病的进展可能需要几十年。心血管疾病的一个常见特征是增加对内皮细胞和心肌细胞的氧化损伤,其可引起心脏功能失常,心脏和血管系统的慢性损伤,导致心力衰竭。萝卜硫素、t-BHQ、MG132、白藜芦醇和α-脂肪酸对NRF2的药理学激活,被证明可以挽救心力衰竭的大鼠(141)。相反,αB晶体蛋白突变的心肌肥大小鼠模型中NRF2慢性激活导致还原性应激(142),这表明NRF2的受控激活可以预防心脏功能障碍,而延长激活可能会导致有害影响。
慢性氧化应激和炎症也是慢性肾病(CKD)和慢性肝病的常见特征。至少对于没有心脏危险因素的患者,CDDO-Me仍然是最有希望的治疗方法,已达到临床试验阶段(143),并且CDDO-Im已证明可预防药物诱导的肝损伤,并减少非酒精性脂肪性肝病模型(144)中的肝脏脂肪积累。这些研究表明,在与慢性炎症和ROS产生相关的疾病中,NRF2的激活可保护机体免受氧化应激;然而,延长NRF2通路的激活可导致代谢变化,引起还原应激促进疾病进展。
 
靶向NRF2的临床试验和基于NRF2疗法的药物重新定位
如上所述,几种NRF2活化剂已开始临床试验,以治疗多种病理;然而,只有DMF已被批准用于治疗复发性MS。目前最流行的一种方案是膳食补充萝卜硫素,测试对慢性阻塞性肺病(ClinicalTrials.gov Identifier NCT01335971)(145)、暴露于臭氧和其他空气污染物(NCT01625130, NCT01437501)(146,147)、囊性纤维化(NCT01315665)、哮喘(NCT01845493)、镰状细胞病(NCT01715480)(148)的治疗,头颈癌(NCT03182959,NCT03268993和NCT03402230)疗效有限或尚未报告。最近的几项临床试验还测试了萝卜硫素对自闭症谱系障碍(NCT0256148)和精神分裂症(NCT01716858)(149)相关症状的治疗,以及在II型糖尿病患者中正进行一项研究(NCT0281448)。有趣的是,局部萝卜硫素在保护皮肤免受紫外线相关损伤方面进行了测试(NCT03126539)。其他的NRF2活化剂也在研究中,如姜黄素治疗晚期糖尿病肾病(NCT03262363),以及最近完成的白藜芦醇治疗慢性肾病(NCT02433925)的试验。RTA 408对线粒体肌病患者(NCT0225422)和弗里德赖希共济失调患者(NCT02255435)的试验正在进行。
药物重新定位的想法也越来越受欢迎。最近的两个例子是DMF治疗PD(150)和Bardoxolone治疗镰状细胞病(151)和肺动脉高压(NCT02036970)。利用药物化学方法衍生已有的治疗方法来提高其特异性和疗效是另一种有趣的可能性。此外,最近研究趋势向非亲电小分子NRF2-KEAP1相互作用的调节剂转变,以减少脱靶效应(80)。研究目的应该是发现新的疗法和优化目前的方法。
 
总结要点
1、NRF2与病理状态之间关系复杂,开发有效治疗方法之前需要仔细评估。
2、通过靶向NRF2的负调节子,可以激活NRF2途径。
3、抑制NRF2途径已被证明是一种挑战,最有希望的策略是干扰NRF2-sMAF-ARE结合。
4、NRF2通过AREs直接或间接调控其他转录因子控制多个转录靶点,表明其在细胞存活中的核心作用。
5、激活NRF2在实验性疾病模型中显示出巨大的成功;然而,许多癌症/代谢性疾病的NRF2水平长期升高,表明在某些情况下需要靶向NRF2抑制剂。
6、尽管有几种NRF2活化剂已用于临床试验,但只有DMF被FDA批准用于治疗MS。
7、通过现有药物的用途改变或衍生化,重新定位NRF2疗法可能会增加基于NRF2疗法的数量。
 
未来问题
1、我们如何缩小从实验室到临床治疗间的距离?尽管过去20年的研究已经清楚地表明了NRF2在疾病中的双重作用,但临床批准的治疗方法的数量仅限于DMF。
2、在疾病中靶向NRF2的正确时机是什么?NRF2的有益或有害激活与时间和疾病背景有关,这对发展基于NRF2的治疗方案提出了重大挑战。
3、为什么激动剂间存在差异?已报道了多种NRF2激动剂,但它们显示了ARE调控基因的差异激活和疾病相关效应,可能是由于与其他调节模式的协同效应。
4、能开发出特定的NRF2抑制剂吗?需要NRF2的靶向抑制剂,因为目前的选择已显示出脱靶效应。

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