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Nrf2 在肿瘤化学预防中的研究进展

发表于:2017-02-22   作者:陈楠,胡容,郭青龙   来源:《药物生物技术》 2010:4   点击量:

摘要
肿瘤的化学预防目前是肿瘤治疗中的热点。大量的实验结论表明内源和外源的化学损伤是引起肿瘤发生的一个重要原因, 所以减少化学损伤以及限制致癌活性分子就是化学预防的重点。机体内抵抗这种损伤主要是通过激活转录因子Nrf2(nuclear facto r E2 p45-r elated factor 2)。Nrf2 可以通过激活抗氧化反应元件ARE(antiox idant-respo nse-element)来起到对抗致癌化学损伤的作用。文章综述了Nrf2 在肿瘤化学预防中所起的主要机制、影响因素以及基于Nrf2 的化学预防剂。
 
关键词
化学预防;核相关因子-2 ;抗氧化反应元件
 
中图分类号 R730.1   文献标志码 A   文章编号 1005 8915(2010)05 0452 05
 
肿瘤的发生是一个包括分子、细胞突变的多步骤过程, 大体可以分为3 个阶段:起始阶段、促进阶段、发展阶段。起始阶段是一个快速并且不可逆的过程, 在这个过程中, 细胞初步接触致癌物质, 致癌物质分散转移到新陈代谢旺盛的组织和器官, 与靶细胞的DNA 共价作用,导致基因损伤。与起始阶段不同, 促进阶段是一个相对冗长并且可逆的阶段, 大量的肿瘤前细胞在这个阶段产生。作为肿瘤发生的最后一个阶段, 发展阶段主要包括细胞的增殖、侵袭和转移。所以,控制肿瘤生长的一个有效方法就是抑制、逆转或者延迟肿瘤前细胞的生长。目前, 化疗药物的主要作用对象是肿瘤的发展阶段, 通过抑制肿瘤细胞生长, 促进肿瘤细胞凋亡、分化来治疗肿瘤。但是化疗药物具有自身毒性过大, 长期使用肿瘤细胞会产生耐药性或者交叉耐药性等问题, 临床疗效一直不是很稳定。所以人们开始研究是否有新的方法或者药物可以在肿瘤起始或者发展的时候就可以阻断肿瘤的产生, 遵循这种思路, 化学预防应运而生。化学预防主要是在肿瘤临床表现之前就用食物疗法或者用药物介入来阻断、抑制甚至逆转肿瘤形成过程, 并且在大量的体内外实验中得到了证明。
 
1  化学预防和I I相代谢酶
“ 化学预防” 这个概念第一次是由Michael Spo rn 于20世纪70 年代中期提出, 指的是用相对无毒性的天然或者人工合成药物来阻断、抑制或者逆转肿瘤发生。根据Wa ttenberg的概括, 化学预防剂主要分为两种:阻断剂(Bloking agents)和抑制剂(Suppressing agents)。阻断剂的主要机制是阻止致癌物质到达靶区域或者是阻止其与细胞内重要大分子譬如DNA 、RNA 和蛋白相互作用。阻断剂可以减少致癌物质的代谢活化和形成, 或者促进致癌物质排出体外, 起到阻断的作用。抑制剂主要是抑制肿瘤前细胞的形成, 包括使肿瘤细胞致癌基因的失活,激活肿瘤抑癌基因, 抑制血管生成和促进肿瘤细胞凋亡和分化。
 
引起人类致癌作用的主要因素包括遗传突变、氧化应激和炎症反应。其中, 遗传突变是肿瘤发生的主要起因,表现在由外源性的致癌物质或者内源性活性氧(ROS)所引起的DNA 损伤。而慢性炎症与癌症的发生有密切的关系, 因为慢性炎症所引起的活化的免疫细胞会释放出来大量譬如ROS 、还原性氮氧族(RNS)等物质, 并且促进细胞因子和生长因子的水平升高, 这些都会导致细胞DNA 损伤, 细胞增殖和侵袭。基于这些概念, 通过诱导亲电子解毒酶和抗氧化蛋白的表达来抑制这些过程, 就成为预防癌变的有效途径。正常情况下, 许多致癌物质是经过代谢活化产生亲电子中间体, 转化后直接损伤DNA。I 相药物代谢酶常常可以介导致癌物质的代谢活化, 而II 相药物代谢酶则可以通过结合亲水分子如GSH 和葡萄糖醛酸, 促使致癌物质的消除。II 相药物代谢酶主要包括过氧化氢酶(catalase , CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(g lutathione S-transferase , GS T)、环氧化物水解酶(epo xide hy dr olase)、磺基转移酶(sulfo transferase)、乙醛基转移酶(scetyltransferase)、醌氧化还原酶(quino ne o xido reductase1, NQO1)、血红素加氧酶(heme ox yg ena se-1 , H O-1)、葡糖醛酸转移酶(g lucurony l transfe rase)、乙醛脱氢酶(aldehy de dehy drog ena se)等。临床上用II相代谢酶诱导剂来减少遗传毒性, 清除体内的ROS 以及通过抑制环氧合酶-2(COX-2)来减少炎症的发生。莱菔硫烷(sulfo raphane)是在十字花科植物中发现的一种代表性的癌化学阻断剂, 它不直接与自由基或活性氧物质发生反应, 而是通过激活Ⅱ相代谢酶基因上游启动子区域一些共同的抗氧化反应元件, 诱导Ⅱ 相代谢酶基因的表达, 以增强机体抗氧化、抗突变和抗肿瘤的能力,Dhakshinamoo rthy 等通过大量的动物实验证明了通过激活II相代谢酶可以达到肿瘤化学预防的作用。与Ⅰ相代谢酶不同的是Ⅱ相代谢酶的诱导不会增加致癌风险, 因此能诱导Ⅱ相代谢酶的化学物质被认为具有癌化学预防能力。
 
2  抗氧化反应元件(ARE)与Nrf2
研究表明, 参与化学致癌物质体内生物转化的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶是由共同的启动子元件来调控[ 8] 。异源性物质反应元件(x eno biotic re sponsive element , XRE)由转录因子芳香烃受体(a ryl hy dr ocarbon recepto r, AhR)激活, 主要调节Ⅰ 相代谢酶表达。近年来在Ⅱ 相代谢酶基因的上游启动子区域发现了一段抗氧化反应元件(antio xidant responseelement , ARE), 当机体遇到外源性物质、氧化应激刺激或者紫外线照射时, 这个顺式增强子被激活, 诱导II相代谢酶的表达。突变分析实验发现ARE 的核心序列是GTGACA***GC, 并且这个序列广泛存在于响应Nrf2 介导的下游基因中。
 
Nrf2 存在于大量的细胞和组织中, 它是包括P45-NFE2、Nrf1、Nrf2 、Nrf3 碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)蛋白家族中的一员, 并且是活力最强的一个, 具有高度保守的CNC(cap?n?collar)结构区域。Nrf2结构中的亮氨酸区域可以结合DNA , 酸性区域则是转录激活的关键。Co pple 等证明了Nrf2 被激活后发生核内转位,与其他的bZIP 蛋白包括Jun (c-Jun, Jun-D, and Jun-B)和small M af (MafG , MafK, M afF)等形成异二聚体结合到ARE 元件, 参与下游Ⅱ 相代谢酶基因的调控。Kobayashi和Yamamo to用Nrf2-/-小鼠模型发现, 当有外源氧化刺激时, Nrf2 缺失的小鼠体内NQO1 的表达不明显, 但用Nrf2-cDNA 在体内表达Nr f2 后, 可以发现NQO1 基因的显著上调, 这表明了Nrf2 在体内调节NQO1 对抗氧化应激中扮演了一个重要角色。Thimmulappa 等在给Nrf2-/-鼠和野生型鼠喂食异硫氛酸盐后, 首次利用基因芯片方法分析了鼠小肠中Nrf2 下游基因组目标基因, 结果发现了大量Nrf2 调节的解毒酶、抗氧化蛋白和降低毒物毒性的细胞保护蛋白表达水平升高。这些结果都证明了Nrf2是激活II 相代谢酶的重要因素, 同时表明Nrf2 是参与化学预防的重要蛋白。
 
3  Nrf2 的调节系统
3.1  Nrf2/Keap1 系统
Keap1(Kelch-like ECH-associa ting pro tein 1)在调节Nrf2 的活性系统中扮演一个重要的角色。基本序列分析显示人源的Keap1 包括5 个区域:1)氨基末端;2)扩展复合区域和BTB区域(Bric a brac);3)富含半胱氨酸的插入区域(IVR);4)双甘氨酸/ Kelch 片段区域;5)羧基端(CT R)。Keap1 的主要功能是作为cullin3/ ring box 1(Cul3/ Rbx 1)E3 泛素化连接酶复合物的转接器, 包括了2 个功能区域:与Nr f2 结合的Kelch/ DGR 区域以及与cullin3的末端相互作用的BTB 区域。定向诱变Keap1 BTB区域中的保守丝氨酸(S104A)证明Nrf2 可以与Keap1 结合。正常情况下, Keap1 的氨基酸末端BTB 区域结合Cul3, 羧基端Kelch 区域结合Nrf2 , 导致Nrf2 的降解反应,细胞质中Keap1/Cul3/ Rbx 1 复合物不停地降解Nrf2 。当有氧化应激刺激细胞的时候, Nrf2 从Keap1 的复合物中解离出来, 转移到细胞核中, 进而激活ARE 介导的基因表达。大量的研究表明Keap1 中的半胱氨酸区域在传感ARE 诱导剂和氧化应激中扮演了重要的作用。一些独立的实验证明了Keap1 半胱氨酸残基中硫氢基在遇到氧化、还原、烷基化反应时会被修饰, 而在这些半胱氨酸残基中Cy s151, 273 和288 被证明了可以调节Nrf2 功能。Cy s151突变不会影响Keap1 降解Nrf2, 但是会阻止Keap1 响应亲电试剂刺激。而Cy s273 或者Cys288 残基突变可以阻断Keap1 降解Nrf2, 这就表明了Cy s272 和Cy s288 是Kea p1 介导Nrf2 降解反应的重要区域。
 
序列同源性和序列分析实验表明Nrf2 在Neh2 区域中含有2 个Keap1 的结合区域:影响Nrf2 降解反应的ETGE 序列和Keap1 结合所必需的DLG 序列。实验发现ETGE 区域缺失可以显著降低DLG 序列调控Nrf2 与Kea p1 结合的能力, 所以ETGE 被认为是DLG 区域作用的前提条件。在ETGE 序列上游存在一些赖氨酸残基也被证明是Keap1 结合Nr f2 的关键区域。关于Keap1 和Nrf2之间的结合, Tong等人认为存在一种“ 锁链和门闩”模型。首先, 两个Keap1 分子经由各自的BTB 区域形成同源二聚体, 在与Nrf2 接近时, Nrf2 结构中亲和力高的ETGE区域如同“锁链” 将Neh2 和Keap1 二聚体中的一个紧紧结合在一起, 亲和力低的DLG 区域作用就如同“门闩” 和另外一个结合在一起。“锁链” 和“门闩” 是通过一个富含赖氨酸的α螺旋结合在一起的, 在α螺旋表面有67 个赖氨酸残基, 因为这些赖氨酸残基是雌三醇连接酶诱导的Keap1 介导的遍在蛋白化的靶点, 所以这些赖氨酸残基也可能是调节Nrf2 的重要因素。这种双位结合不是很稳定, 因为低亲和力的DLG 区域和Keap1 的结合就如同“ 门闩” 一样, 当有外源氧化刺激时, 就如同钥匙打开锁一样, 混合物中Kea p1 会变形而使结合变脆弱。所以DLG 序列被认为是Kea p1 通过蛋白酶体降解抑制Nr f2 的信号开关。
 
大量的实验证明了Keap1 结构的变化或者Nrf2 从Nrf2/ Keap1 相互作用中分离都将导致A RE 介导的基因转录水平上调。因为Nrf2 的抗氧化剂和外来刺激可以导致ROS 和亲电子试剂的产生, 所以可以认为这些分子可能在激活ARE 介导的基因表达中扮演第二信使的作用。一些蛋白酶包括PKC , ERK , MAPK 和PERK, 证明可以修饰Nrf2 并使它从Kea p1 中分离出去。
 
3.2  Nrf2 的其他调节机制
Bach1(BTB and CNC homology 1 , basic leucine zipper transcriptio n facto r 1)是一种存在于组织中的转录抑制剂,与Nrf2 调节密切相关。在正常情况下, Bach1 与Maf蛋白形成异二聚体, 与ARE 结合抑制下游基因表达。当机体有氧化应激时, Bach1 从ARE 中分离出来, 位置被Nrf2 取代, Bach1 过多可以抑制Nrf2 与A RE 的结合。Nrf2 从Keap1 中分离暴露到转移进入细胞核中大概需要2 h , 其间伴随着糖原合酶激酶3β (GSK3β)激活机制,GSK3β 可以阻止Nrf2 激活基因表达。GSK3β 是一种多功能丝氨酸— 苏氨酸激酶, 在多种通路中扮演了不同的角色。GSK3β 可以磷酸化一个酪氨酸激酶Fyn , 导致Fy n 核定位。Fy n 使Nrf2 的568 位的酪氨酸磷酸化,导致Nrf2从核中排出, 并与Keap1 相结合降解。除此之外,Wang等还证明了Nrf2 可以被维甲酸通过激活维甲酸受体α来抑制。维甲酸受体α可以取代ARE 与入核的Nr f2 结合, 使得Nrf2 无法发挥生物活性。这些调节重要对于Nrf2 的基因抑制都有极其重要的作用。
 
4  通过Nr f2/ Keap1/ ARE 通路的化学预防药物
4.1  莱菔硫烷(sulforaphane)及其类似物
莱菔硫烷(sulfo rapha ne)是异硫氰酸盐的一种, 广泛存在于成熟的甘蓝或者甘蓝茎中, 大量的实验证明它可以上调ARE 介导的酶活性。Thimmulappa 证明莱菔硫烷可以通过与Keap1 结构中巯基作用, 直接影响Keap1结合Nrf2 的能力, 促进Nrf2 活化转录进入细胞核, 激活NQO1、GST 等II 相代谢酶。并且通过对Nrf2 缺失的小鼠实验对比发现, 莱菔硫烷上调II 相代谢酶的作用不明显。大量的实验证明莱菔硫烷通过激活Nrf2 通路对抗致癌物质诱导的肿瘤发生, 起到细胞保护的作用。Mo rimitsu等发现从日本辣根山葵中提取的莱菔硫烷的类似物6-HITC 可以诱导GS T 的表达并且也可以诱导Nrf2 活化进入细胞核, 激活Nrf2/ ARE 通路。6-H ITC 在小鼠上皮细胞RL-34 诱导实验中, 可以发现细胞中GSTA1 和GSTP1同工酶表达显著提高, 同时6-HITC也在Nrf2 缺失小鼠中上调II 相代谢酶的作用不明显, 这也再次说明了Nr f2 在化学预防中的重要性。
 
4.2 姜黄素(Curcumin)和咖啡酸苯乙基脂(CAPE)
姜黄素是从植物沉金根茎中提取的黄色色素, 大量动物模型实验已经证明其可以抑制肿瘤的起始阶段和促进阶段。局部应用姜黄素可以抑制DMBA 和TPA 诱导的皮肤癌;另外, 通过口服摄取姜黄素可以抵抗贲门窦、十二指肠和结肠的致癌实验。CAPE 是蜂胶中的酚结构, 具有抗癌和抗炎活性。H uang 等证明了CAPE 可以抑制氧化偶氮甲烷诱导大鼠结肠突变和阻断TPA 诱导的小鼠皮肤癌模型肿瘤发生。在猪肝脏上皮细胞模型中可以发现,姜黄素和CAPE的化学预防的作用机制是通过产生的α、β 不饱和酮, 通过与Keap1 结构中半胱氨酸区域进行麦克反应来破裂Nrf2-Kea p1 复合物, 使Nrf2 从Keap1/ Nrf2 复合物中游离出来,转移进入细胞核中, 激活ARE 功能。姜黄素和CAPE 可以显著增强H O-1 的表达和活力, 并且可以激活Nrf2 的上游P38 通路。
 
4.3 二硫杂环戊二烯硫酮化合物:奥替普拉和茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮(ADT)
奥替普拉是1 , 2-二巯基-3-硫酮结构化学合成物, 最初作为治疗吸血虫病的药物。Kang 和他的同事[ 27] 证明了奥替普拉通过诱导PI3K 通路介导的Nrf2 激活来诱导的GS TA2 的表达和自身mRNA 转录水平。Kensler 等紧接着在体内外实验中发现奥替普拉可以诱导ARE 调节的酶包括:GST , NQO1 , GCL, 环氧化物水解酶和黄曲霉毒素B1 乙醛还原酶, 并且可以阻止实验中用致癌剂诱导的致癌反应。另一种二硫杂环戊二烯硫酮化合物ADT 可以通过诱导ARE 介导的基因表达达到化学预防的作用。Warnet等在Sw iss 雌性小鼠口服扑热息痛1 h 之前给予ADT 实验发现ADT 有强大的保肝作用, 在剂量少于100 mg/ kg 就可以增加体内的谷胱甘肽水平, 并且可以抑制实验性肝癌的发生。通过对ADT 和奥替普拉的研究发现1 , 2-二巯基-3-硫酮结构都可以提高GST 的水平。
 
4.4 其他化合物
白藜芦醇是蓼科植物虎杖的根茎提取物, 主要结构是蒽醌萜类化合物, 有实验表明它在有氧化应激时可以通过激活Nrf2 来上调H0-1 来保护PC12 细胞, 并且可以抑制乳腺癌的发生。4' -溴二苯并伍环是人工合成的类黄酮类化合物, 作为NQO1 的诱导剂, So ng  等通过大鼠口服4' -溴二苯并伍环实验检测证明其可以抑制DMBA 诱导的乳腺癌并且可以显著增加癌症的潜伏期。
 
5 结论
II 相代谢酶可以排除或者使致癌物和其他有毒物质钝化, 化学预防的途径之一就是可以通过激活II 相代谢酶或者抗氧化酶来使致癌物质去毒化。而Nrf2 作为编码I I 相代谢酶的重要转录因子, 为人类与癌症的斗争创造了一个新的平台。大量的化学预防剂被证明可以诱导Nr f2, 进而提高A RE 介导的II 相代谢酶的转录水平, 最后促进致癌物质的去毒化和失活。随着细胞内激活Nrf2 和其靶基因的信号通路的逐步了解, 进一步研究Nrf2 及其相关信号通路仍然对具有临床治疗能力的新型化学预防剂的设计有着重大的意义。
 
本文来源于《药物生物技术》 2010:452-456,如有侵权,请联系我们删除
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