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黑树莓在癌症预防中的潜力
发表于：2019-02-20 作者：admin 来源：本站 点击量：16897
黑树莓是一种源自北美的结黑色果子的树莓。随着研究不断深入，发现黑树莓富含花色苷和鞣花酸，并且这两种物质对健康都有着重要意义，黑树莓也因此越来越受到欢迎，人们对黑树莓的需求也不断增加。黑树莓的热门研究方向包括其化学成分、药理活性及其在细胞和分子水平的作用机制之间的相互作用，并且绝大多数的研究都集中在化学预防和抗癌作用上。本综述总结了多年来黑树莓的化学成分和抗癌活性的相关数据。
黑树莓原产东部北美，白皮糙莓生长在北美的西部，因为水果的颜色都是黑色，黑树莓与白皮糙莓还被叫过同一个名字——黑树莓。黑树莓的原产地还包括欧洲的一些国家，如捷克共和国、斯洛伐克、俄罗斯和波兰。
插田泡，也被称为韩国黑树莓，是一种用于制作韩国黑树莓酒的灌木，原产东亚。目前基于果肉中花色苷成分的含量及DNA的分析，发现大多数栽培的韩国的插田泡实际上就是黑树莓。
直到19世纪，黑树莓才被驯化，而自那之后，黑树莓的商业生产却一直在减少。这主要是因为没有可以抗病的黑树莓品种，而且相对来说大众也都更喜欢红树莓。尽管如此，近年来，黑树莓的需求也一直在增长，这很大程度上是因为许多研究发现黑树莓富含花色苷，并且具有潜在的健康益处。一些在美国市场上流行的黑树莓品种包括Munger, Bristol, Jewel, MacBlack和Haut。波兰的一种黑树莓品种Litacz，也是Bristol通过自然授粉而进化的。
虽然有关红树莓的研究很多，但主要都是抗炎及抑菌活性的测定，黑树莓的相关研究则更多集中在其体内外或体外模型中的抗癌作用。本综述总结了黑树莓这些年来在化学预防和抗癌活性上的相关研究。
据报道，黑树莓中花色苷含量是红树莓（Rubus idaeus）的5倍多，并且与其他悬钩子属种如黑莓、marionberries和波森莓相比，其花色苷含量最高。
黑树莓中的花色苷主要是矢车菊素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-木糖基芸香糖苷，约占黑树莓果肉中的80％。矢车菊素-3-接骨木二糖苷和天竺葵素-3-O-芸香糖苷的含量则较少，分别都是花色苷总量的1％至5％。此外，黑树莓中还有其他的花色苷，包括矢车菊素、天竺葵素苷以及芍药苷（表1，见22页）。不同黑树莓品种的总花色苷含量可能也会有差异，根据报道，干的Jewel品种黑树莓中的花色苷含量为1770mg~100g/100g不等，而干的Litacz品种黑树莓中的花色苷含量高达5512mg/100g。
对黑树莓品种Munger, Bristol, Jewel, MacBlack和Haut的总花色苷含量进行了测定，并与几种杂交黑树莓品种进行了比较，发现直接栽种黑树莓的总花色苷含量处于一个平均范围，且和嫁接或扦插等繁殖方式所培育的黑树莓中的总花色苷含量差异很大。据报道，黑树莓种群中高花色苷和低花色苷含量相差约两倍（244.8-541.3mg/100ml果汁），其中，主要两种花色苷的水平也有显著性差异。
虽然关于黑树莓中鞣花酸成分的具体数据非常有限，但鞣花酸确实是是蔷薇科的一大特色组分。据报道，红树莓中的鞣花酸含量可高达总酚含量的85％，而花色苷含量则仅约为12％。通过比较发现，黑树莓中花色苷的浓度比鞣花酸高了四倍，当然，这并不是因为鞣花酸含量低，而是因为黑树莓中花色苷含量较高。于在波兰生长的不同品种的红树莓和黑树莓中地榆素H-6含量研究结果一致，研究发现，黑树莓中的地榆素H-6含量为1482.5mg/100g干重，这与其他水果提取物的含量很相似，而红树莓中的鞣花酸浓度则要高出3-4倍（5045.2mg/100g干重）。
黑树莓中的次级代谢物已被确定属于多酚和简单酚的其他类，虽然它们的含量明显比鞣花酸和花色苷都更低，并且包含了好几种酚类（如表1所示），包括黄烷-3-醇和黄酮醇（主要是槲皮素糖苷）、杨梅黄酮和山奈酚。不同品种的黑树莓和红树莓提取物中的游离鞣花酸的浓度都比较低，为24~50mg/100g干重。
在最近的一项研究中，如表1所示，从黑树莓中把芪类葡萄糖苷：反式白藜芦醇苷和二氢查耳酮：根皮苷分离出来了。黑树莓具有营养价值的其他成分包括维生素C、E，以及高浓度的钙（Ca）、钾（K）、铜（Cu）和铁（Fe）。
虽然急性、短期的炎症通常对机体有益，也是正常免疫应答的一部分，但持续的炎症/氧化环境会损伤健康细胞，长时间下去可能会对细胞结构和功能造成重大的危害，包括DNA损伤，肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭、转移及血管生成，从而促进恶性肿瘤的发生发展。ROS产生及清除的平衡是由各种DNA修复酶以及抗氧化剂维持的，但内源性和外源性抗氧化剂被认为能更有效地保护细胞免受氧化损伤。
众所周知，花色苷具有抗氧化作用，所以已经有很多篇报道概述了黑树莓抗氧化能力的相关研究，并且有的研究还把黑树莓与氧化损伤、肿瘤发生以及几种化学预防联系起来。
通过测定黑树莓品种Jewel以及不同品种的无刺黑莓（Rubus sp.）、红树莓（Rubus idaeus L.）和草莓（Fragaria x ananassa D.）的总抗氧化活性（氧自由基吸收容量），发现，与其他浆果相比，黑树莓不同成熟过程中的平均氧自由基吸收容量最高。这与其他研究的结果一致，即与其他种属的水果如越桔属、悬钩子属、虎耳草科酷栗属相比，黑树莓的抗氧化性最高。
在研究清除不同类型的ROS时发现，黑树莓是O2•-、H2O2以及OH的最佳抗氧化剂，其清除’O2的能力排名第二。在氧化应激条件下，ROS可以导致致癌突变的积累。OH• 导致DNA损伤的产物包括8-羟基鸟苷及其水解产物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG），其中，8-OHdG被广泛用作DNA氧化损伤标志物。在MTT分析中发现，在H2O2诱导氧化应激下，黑树莓乙醇提取物可以促进Caco-2细胞系的细胞活力。
经研究确定，黑树莓中主要的酚类抗氧化剂是矢车菊素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-木糖基芸香糖苷。此外，黑树莓种子提取物中的鞣花酸被发现具有很强的抗氧化特性，且其含量是葡萄籽中鞣花酸的2倍不止。
黑树莓的强抗氧化特性通常与其在癌症等慢性病中的预防作用有关。
黑树莓乙醇提取物可抑制人类CD4+和CD8+ T淋巴细胞的增殖和活力。它也可以调节促炎细胞因子IL-6和IL-2介导的转录因子STAT3和STAT5的磷酸化和转录激活。有趣的是，它们还会限制MDSC（髓源性抑制细胞）的扩增，抑制T淋巴细胞的激活。虽然这似乎与抑制T淋巴细胞的作用相反，但对抑制肿瘤作用也可以起到有益的作用，如在肿瘤微环境中，MDSCs可直接通过分泌促进肿瘤生长的因子来促进血管生成及淋巴管生成。黑树莓提取物不但可以通过抑制MDSCs导致的肿瘤血管生成，还被发现可以通过其他抗血管生成的机制来抑制血管生成，即从源头上抑制血管生成以及抑制血管原的血管生长，血管生长是通过基于组织的体外纤维蛋白凝胶进行测定的。
研究表明，黑树莓提取物具有化学预防作用，能够抑制BPDE诱导激活转录因子AP-1、NFκB、NFAT（活化T细胞的核因子）以及抑制相关基因如VEGF（血管内皮生长因子）、COX-2（环氧合酶2）和TNF-α（肿瘤坏死因子）的表达。已有许多种相关的假设机制来解释上述黑树莓的化学预防作用。一种是通过阻止MAPKs（丝裂原活化蛋白激酶）和IκBa（NFκB的抑制蛋白，一般以失活状态存在于细胞质中）的磷酸化及抑制AP-1和NFκB的活化受损，从而下调VEGF和COX-2。其他数据表明PI-3K/Akt信号转导通路的抑制，可能与抑制AP-1和NFκB的活化受损有关。奇怪的是，依赖于AP-1的iNOS的表达却没有被抑制。这些结果意味着黑树莓成分具有靶向作用于不同信号转导通路的潜力，从而发挥对上皮癌的化学预防作用。在后续研究中，发现抑制由BPDE诱导的NFκB活化作用的主要成分是矢车菊素-3-O-葡糖苷、-3-O-芸香糖苷和-3-O-木糖基芸香糖苷。
在一项SKH-1无毛小鼠的体内研究中，局部使用黑树莓提取物可显著减少皮肤炎症及其癌变。在短期模型中，将小鼠暴露于一定剂量的UV-B辐射下，小鼠出现了小范围的红斑，局部分别用黑树莓提取物或赋形剂处理。处理48小时后，用500μg黑树莓提取物处理的小鼠的炎症反应显著减少，包括皮肤水肿、中性粒细胞活化、p53的蛋白质表达水平和DNA损伤标志物都显著减少。在长期模型中，将小鼠暴露于相同剂量辐射，每周三次，持续25周，同时局部用黑树莓提取物及赋形剂处理，发现与用赋形剂处理的小鼠（每只小鼠平均有30个肿瘤，肿瘤的平均大小为30.2 mm2）相比，用黑树莓提取物处理的小鼠的肿瘤数及肿瘤大小（每只小鼠平均有17个肿瘤，肿瘤的平均大小为10.1 mm2）均有减少。这与肿瘤组织浸润的CD4+和CD3+ foxp3+T细胞的水平显着降低有关，而肿瘤组织浸润的CD4+和CD3+ foxp3+T细胞的水平会促进UV-B诱导的炎症反应和肿瘤发展。
在人体MCF-7乳腺癌细胞系的体外研究中，发现黑树莓提取物有可能使癌细胞对辐射损伤更加敏感。出现这种结果的原因应该是对NFκB的抑制作用，NFκB是癌细胞的一种辐射防护剂。
在另一项口腔鳞状细胞癌（SCC）的研究中，发现黑树莓乙醇提取物有抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制VEGF产生及NOS活性的作用。
为研究黑树莓抑制口腔肿瘤的作用，采用7,12-二甲基苯基蒽诱导的致癌作用模型在仓鼠颊囊进行了实验。与对照组相比，喂食中有5％黑树莓粉末的仓鼠颊囊的肿瘤数量显著减少，然而，喂食10％黑树莓粉末抑制肿瘤生长的作用则不如5％的那么好。
在抗癌研究中，给实验大鼠分别喂食5％和10％的冻干黑树莓粉，发现冻干黑树莓粉可显著减少病灶形成、肿瘤发病率及多样性，从而证明黑树莓可以抑制癌症的发生及发展。有趣的是，5％剂量的黑树莓粉似乎比10％的更有效。其抑制病变的作用与在食管中减少NMBA诱导的前致癌物O6-甲基鸟嘌呤加合物中的影响有关，这说明黑树莓可影响NMBA的代谢，从而防止DNA的损伤。
后启动研究表明，黑树莓除了可以减少NMBA处理的大鼠中肿瘤病灶、数量及大小，还可把一些食管癌和食道乳头状瘤中异常表达的基因调节在正常水平。如表2（见22页）所示，与草莓的冻干提取物相比，黑树莓抑制NMBA诱导的DNA加合物形成更有效，同时还可减少肿瘤的发生率和多样性。从补充大鼠中获得了抑制食管组织培养及微粒体NMBA的有效成分，并被鉴定为矢车菊素-3-O-芸香糖苷、鞣花酸和矢车菊素-3-O-葡糖苷。
在另一项研究中，发现黑树莓提取物包括富含花色苷部分和有机不溶部分（预估含有大量单宁）可抑制癌以及癌前病变中的细胞增殖、炎症、血管生成，这表明了黑树莓抑制不同类型的癌症的作用机制是相似的。此外，研究还发现，含有冻干黑树莓、黑树莓的花色苷及原儿茶酸（主要花色苷代谢产物）的饮食均可同等有效地抑制NMBA诱导的食管肿瘤，然而在35周以后的实验中发现，还是冻干黑树莓粉的效果会略微更好一些。
然而，在一项黑树莓、草莓和蓝莓即不同含量的单宁对大鼠食管癌影响的研究中发现，浆果部分组防止NMBA诱导ESCC的作用并没有显著性差异。这表明黑树莓中的单宁可能并没有化学预防作用。
对食管鳞状细胞癌的肿瘤进展的分子机制研究显示，饮食中加入5％黑树莓粉末可下调食管癌癌前病变中COX-2、iNOS、PGE2和c-Jun（AP-1蛋白家族成员）的mRNA和蛋白质的表达水平。黑树莓提取物也被证明具有抗血管生成特性，可显著抑制食管癌癌前病变中VEGF的表达，还可减少微血管密度（MVD），这都与抑制COX-2和iNOS有关。
此外，黑树莓粉还能通过降低促炎生物标志物COX-2、iNOS、p-NF-κB，可溶性环氧化物水解酶和细胞因子正五聚蛋白-3的活性抑制食管内皮炎症，上述的生物标志物是由IL-1b和TNF-α介导的。
此外，研究还发现黑树莓中的花色苷能抑制DNA甲基转移酶的活性及表达，DNA甲基转移酶对一些人体特定肿瘤包括HTC-116中的DNMT1、DNMT3B以及结肠直肠腺癌细胞系中的Caco-2、SW480的异常甲基化具有重要意义。这些结果表明黑树莓中的花色苷对全黑树莓在结直肠癌中的去甲基化作用是极具意义的。
溃疡性结肠炎是一种可显著增加结直肠癌风险的慢性溃疡性结肠炎（UC），科学家们采用
3％葡聚糖硫酸钠（DSS）诱发溃疡性结肠炎（UC）的小鼠模型评价冻干黑树莓的化学预防效果。研究发现，饮食中丰富的黑树莓粉末可显著减少DSS引起的损伤包括结肠缩短及溃疡，然而，这并没有影响到氧化应激生物标志物（血浆NO和结肠丙二醛）的水平以及和结肠DSS损伤有关的炎性细胞浸润。另一方面，7天的黑树莓粉治疗可抑制结肠组织中TNF-α、IL-1b、COX-2及IκB-α的磷酸化（IκB-α磷酸化后随即降解，随之而来的就是NFκB核因子的激活）。奇怪的是，这项研究的结果表明黑树莓的保护机制更多与其抗炎特性而不是抗氧化活性相关。
还有一些其他的大肠癌动物模型运用于评价黑树莓在体内的功效。化学致癌物氧化偶氮甲烷
（AOM）能够诱发大鼠结直肠癌的发生，该动物模型被广泛用于一些化学预防剂预防结肠癌的作用评价。喂食含有2.5％、5％、10％的冻干黑树莓粉末的大鼠肿瘤多样性分别降低42％、45％和71％，同时可显著减少暴露于AOM的大鼠的DNA氧化损伤，降低尿中的DNA氧化损伤生物标志物8-OH-Dg的表达。
两种基因缺陷小鼠模型APC1638+/-及Muc-/-，可分别自发发展成结直肠癌及结肠炎，可用于评
价黑树莓对结肠癌发展的影响及其潜在机制。在两种模型中，喂饲黑树莓12个星期可显著抑制结直肠肿瘤的发生。APC1638+/-小鼠肿瘤发生率减少45%，单只肿瘤数量减少60%；Muc-/-小鼠的发生率和单只肿瘤数量则都是减少50%。机理研究结果表明，黑树莓可通过抑制β-catenin信号通路（其过度表达与多种类型的癌症相关）抑制APC1638+/-小鼠肿瘤发展，抑制Muc-/-小鼠肿瘤发展则是通过减少慢性炎症。
一项研究为了确定黑树莓对口腔癌的发展具有是否保护作用，将含有冻干黑树莓的粘膜粘附凝胶局部施用于人类口腔粘膜。上皮内瘤样病变患者易患口腔鳞状细胞癌，每日给皮内瘤样病变患者施用黑树莓凝胶4次，为期6周。6周后，在施用黑树莓凝胶的患者中观察到病变组织的退化，在3个肿瘤抑制基因位点：UK4A/ARF、p53和FHIT中观察到杂合性缺失率在统计学上显著降低。此外，还发现用黑树莓凝胶治疗后可显著降低病变上皮中COX-2的水平。在研究过程中，一部分患者对黑树莓凝胶的响应很好。病灶上的蛋白质谱显示，这些高度响应的患者体内的黑树莓代谢和角质形成细胞分化所需的酶的预处理水平更高，这表明在黑树莓治疗中，自己体内的酶活力也是很重要的。
接下来要介绍的这个课题是对口腔内花色苷代谢及其对黑树莓化学预防功效潜在影响的后续研究。每天给患者局部施用10%黑树莓，通过患者的漱口液来评估口腔组织、唾液和口腔菌群中花色苷的代谢水平。通过大量的药代动力学分析和功能活性测定，证明黑树莓中的花色苷在唾液中可持续性存在，并且漂洗黑树莓外用凝胶时，口腔中的花色苷水平更高，还发现原儿茶酸（稳定的花色苷降解产物）及原儿茶酸葡萄糖苷、葡糖醛酸化的花色苷缀合物（被认为是生物活性花色苷代谢物）在唾液中也可持续存在。这种肠溶性花色苷的循环过程，很大程度上是被口腔的β-葡萄糖苷酶催化发生的，并且患者间的个性化也可能影响局部施用黑树莓化学疗法的效果。
一项研究对结直肠癌及结直肠息肉患者进行了黑树莓的干预试验，患者均是在预定手术的前2-4周接受了每天60g干黑树莓粉的治疗。比较治疗前后肿瘤/息肉组织的活检结果发现，黑树莓粉对结直肠癌的两种预后生物标志物有影响：Ki-67和CD105。在活检标本中发现，Ki-67蛋白（与细胞增殖相关）和CD105（这是TGF-β受体复合物的一部分，并在血管生成中具有关键作用）的水平在黑树莓治疗后均显著降低。并且，用TUNEL法检测DNA片段化结果显示，用黑树莓治疗后的肿瘤细胞凋亡率升高。
在一项为期9个月的针对家族性腺瘤性息肉病高危患者试验中，14名患者每天采用两种不同的黑树莓粉治疗方式，一种是口服黑树莓粉+BRB直肠栓剂的形式，另一种则是口服安慰剂+BRB直肠栓剂。结果发现，对黑树莓治疗有响应的患者息肉负荷显著下降，但息肉数量并没有下降，同时这些患者还有其他变化：细胞增殖率下降，DNMT1表达减少，CDKN2A的甲基化下降。其中，CDKN2A是抑癌基因p16的启动子基因。有3例患者对黑树莓的治疗无反应，他们的腺瘤数目或分子标志物水平基本没有变化。
在另一项关于结直肠癌的研究中，患者每天接受60g黑树莓粉，为期9周，并抽血检测细胞凋亡、细胞增殖和血管生成的相关标志物的变化。结果表明，浆果治疗对腺癌及邻近未分化组织的增殖（Ki67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）都具有积极的作用。同时，患者接受浆果治疗10天后，血浆中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）浓度显著升高，IL-8浓度显著降低，其他血浆细胞因子则无明显变化。由于IL-8的高水平表达是肿瘤发展的一个强有力的预测因子，因此作者提出IL-8和GM-CSF的变化可以作为结直肠癌患者消费黑树莓治疗反应的预测指标。
一项在巴雷特食管的癌前病变患者中进行的研究显示，尽管尿液中检测的氧化应激生物标志物的水平显著降低，但巴雷特食管病灶的病变长度并没有显著改变。作者认为，这可能是当黑树莓粉混合水后以悬浮液形式施用时，因为通过食管速度太快，还不足以让局部充分吸收活性化合物进入病灶。
黑树莓通过影响致癌物质代谢、降低癌前细胞的生长速度、促进细胞凋亡、减少组织炎症和抑制血管生成等机制对多种类型肿瘤均有一定的抑制作用。动物和体外研究的结果使得黑树莓成为肿瘤早期化学预防的一种有前景的物质，但是，黑树莓的作用在临床试验中并没有得到非常明确的肯定。
花色苷似乎是黑树莓化学预防活性的主要贡献者，但关于黑树莓果肉有效成分的生物利用度和代谢的相关研究则很少。花色苷的生物利用度较低（血浆＜1%），但已有研究发现在口腔和结肠组织中存在其天然形式，提示它们可能可以通过消化道与消化道组织相互作用。另一个存在的问题是不同患者对多酚摄入的估计量及其比较不易进行，因为这可能存在很大的个体差异性，这种个体差异性与多个因素有关，如肿瘤部位附近的分子信号、自身体内酶的活性和微生物群。
在目前采用的临床试验方法中也存在一些明显的不足。这些临床试验通常是短时间完成的，并且患者人数较少，这些临床试验并不能提供足够的关于长期改善慢性疾病的数据。因此，在黑树莓化学预防研究中需要考虑更多人体长期的临床试验。临床试验中的另一个问题是患者对治疗的反应，这与患者体内生物活性浆果成分的代谢及吸收速率有关，一些研究人员确定了识别非侵入性生物标志物的必要性，这些生物标志物可以预测更有可能从化学预防治疗中受益的个体。
1. 引 言
蔷薇科悬钩子亚属属于悬钩子属，包括结红色果子的树莓如最受欢迎的红树莓(Rubus idaeus L.)和结黑色果子的树莓，包括黑树莓（Rubus occidentalis L.）、白皮糙莓（Rubus leucodermis Douglasex Torr.& A. Gray）和插田泡（Rubus coreanus Miq）。黑树莓原产东部北美，白皮糙莓生长在北美的西部，因为水果的颜色都是黑色，黑树莓与白皮糙莓还被叫过同一个名字——黑树莓。黑树莓的原产地还包括欧洲的一些国家，如捷克共和国、斯洛伐克、俄罗斯和波兰。
插田泡，也被称为韩国黑树莓，是一种用于制作韩国黑树莓酒的灌木，原产东亚。目前基于果肉中花色苷成分的含量及DNA的分析，发现大多数栽培的韩国的插田泡实际上就是黑树莓。
直到19世纪，黑树莓才被驯化，而自那之后，黑树莓的商业生产却一直在减少。这主要是因为没有可以抗病的黑树莓品种，而且相对来说大众也都更喜欢红树莓。尽管如此，近年来，黑树莓的需求也一直在增长，这很大程度上是因为许多研究发现黑树莓富含花色苷，并且具有潜在的健康益处。一些在美国市场上流行的黑树莓品种包括Munger, Bristol, Jewel, MacBlack和Haut。波兰的一种黑树莓品种Litacz，也是Bristol通过自然授粉而进化的。
虽然有关红树莓的研究很多，但主要都是抗炎及抑菌活性的测定，黑树莓的相关研究则更多集中在其体内外或体外模型中的抗癌作用。本综述总结了黑树莓这些年来在化学预防和抗癌活性上的相关研究。
2. 化学成分
黑树莓的化学成分主要通过HPLC检测来确定，常用的检测器是UV-vis和ESI/MS。由于其悬钩子属物种的特性，研究发现，黑树莓中含有多种多酚，尤其是花色苷和鞣花酸。据报道，黑树莓中花色苷含量是红树莓（Rubus idaeus）的5倍多，并且与其他悬钩子属种如黑莓、marionberries和波森莓相比，其花色苷含量最高。
黑树莓中的花色苷主要是矢车菊素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-木糖基芸香糖苷，约占黑树莓果肉中的80％。矢车菊素-3-接骨木二糖苷和天竺葵素-3-O-芸香糖苷的含量则较少，分别都是花色苷总量的1％至5％。此外，黑树莓中还有其他的花色苷，包括矢车菊素、天竺葵素苷以及芍药苷（表1，见22页）。不同黑树莓品种的总花色苷含量可能也会有差异，根据报道，干的Jewel品种黑树莓中的花色苷含量为1770mg~100g/100g不等，而干的Litacz品种黑树莓中的花色苷含量高达5512mg/100g。
对黑树莓品种Munger, Bristol, Jewel, MacBlack和Haut的总花色苷含量进行了测定，并与几种杂交黑树莓品种进行了比较，发现直接栽种黑树莓的总花色苷含量处于一个平均范围，且和嫁接或扦插等繁殖方式所培育的黑树莓中的总花色苷含量差异很大。据报道，黑树莓种群中高花色苷和低花色苷含量相差约两倍（244.8-541.3mg/100ml果汁），其中，主要两种花色苷的水平也有显著性差异。
虽然关于黑树莓中鞣花酸成分的具体数据非常有限，但鞣花酸确实是是蔷薇科的一大特色组分。据报道，红树莓中的鞣花酸含量可高达总酚含量的85％，而花色苷含量则仅约为12％。通过比较发现，黑树莓中花色苷的浓度比鞣花酸高了四倍，当然，这并不是因为鞣花酸含量低，而是因为黑树莓中花色苷含量较高。于在波兰生长的不同品种的红树莓和黑树莓中地榆素H-6含量研究结果一致，研究发现，黑树莓中的地榆素H-6含量为1482.5mg/100g干重，这与其他水果提取物的含量很相似，而红树莓中的鞣花酸浓度则要高出3-4倍（5045.2mg/100g干重）。
黑树莓中的次级代谢物已被确定属于多酚和简单酚的其他类，虽然它们的含量明显比鞣花酸和花色苷都更低，并且包含了好几种酚类（如表1所示），包括黄烷-3-醇和黄酮醇（主要是槲皮素糖苷）、杨梅黄酮和山奈酚。不同品种的黑树莓和红树莓提取物中的游离鞣花酸的浓度都比较低，为24~50mg/100g干重。
在最近的一项研究中，如表1所示，从黑树莓中把芪类葡萄糖苷：反式白藜芦醇苷和二氢查耳酮：根皮苷分离出来了。黑树莓具有营养价值的其他成分包括维生素C、E，以及高浓度的钙（Ca）、钾（K）、铜（Cu）和铁（Fe）。
3. 生物学活性研究
活性氧（ROS）是内源代谢反应过程中正常的细胞代谢产物，在应对各种环境条件下的细胞信号通路中发挥着重要作用。它们来源于免疫系统中的细胞，是炎症部位释放的一种可溶性分子，以趋使更多的炎细胞到达受损部位。氧化应激诱导的炎症反应可以介导信号转导级联，从而导致多种转录因子的激活，如核因子κB（NF-κB）、激活蛋白1（AP-1）、核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）、信号转导子和转录激活因子3（STAT3），其中转录激活因子3可介导细胞应激反应并诱导炎性细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL-1，IL-2，IL-6）、环氧合酶-2（COX-2）以及一氧化氮合酶（NOS）酶表达。虽然急性、短期的炎症通常对机体有益，也是正常免疫应答的一部分，但持续的炎症/氧化环境会损伤健康细胞，长时间下去可能会对细胞结构和功能造成重大的危害，包括DNA损伤，肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭、转移及血管生成，从而促进恶性肿瘤的发生发展。ROS产生及清除的平衡是由各种DNA修复酶以及抗氧化剂维持的，但内源性和外源性抗氧化剂被认为能更有效地保护细胞免受氧化损伤。
众所周知，花色苷具有抗氧化作用，所以已经有很多篇报道概述了黑树莓抗氧化能力的相关研究，并且有的研究还把黑树莓与氧化损伤、肿瘤发生以及几种化学预防联系起来。
4. 抗氧化活性
黑树莓的独特性在于其高抗氧化能力，并且许多研究都报道，与其他浆果相比，黑树莓的抗氧化性最强。通过DPPH、FRAP、ABTS方法测定抗氧化能力时，黑树莓乙醇提取物被证明具有最高的抗氧化活性。通过测定黑树莓品种Jewel以及不同品种的无刺黑莓（Rubus sp.）、红树莓（Rubus idaeus L.）和草莓（Fragaria x ananassa D.）的总抗氧化活性（氧自由基吸收容量），发现，与其他浆果相比，黑树莓不同成熟过程中的平均氧自由基吸收容量最高。这与其他研究的结果一致，即与其他种属的水果如越桔属、悬钩子属、虎耳草科酷栗属相比，黑树莓的抗氧化性最高。
在研究清除不同类型的ROS时发现，黑树莓是O2•-、H2O2以及OH的最佳抗氧化剂，其清除’O2的能力排名第二。在氧化应激条件下，ROS可以导致致癌突变的积累。OH• 导致DNA损伤的产物包括8-羟基鸟苷及其水解产物8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG），其中，8-OHdG被广泛用作DNA氧化损伤标志物。在MTT分析中发现，在H2O2诱导氧化应激下，黑树莓乙醇提取物可以促进Caco-2细胞系的细胞活力。
经研究确定，黑树莓中主要的酚类抗氧化剂是矢车菊素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-木糖基芸香糖苷。此外，黑树莓种子提取物中的鞣花酸被发现具有很强的抗氧化特性，且其含量是葡萄籽中鞣花酸的2倍不止。
黑树莓的强抗氧化特性通常与其在癌症等慢性病中的预防作用有关。
5. 黑树莓与癌症的关系
研究发现，黑树莓可调节机体免疫功能，这与慢性炎症及相关体外肿瘤进展都有一定的关系。此外，各成熟阶段的水果可通过减少一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的产生来减少促炎症过程。黑树莓乙醇提取物可抑制人类CD4+和CD8+ T淋巴细胞的增殖和活力。它也可以调节促炎细胞因子IL-6和IL-2介导的转录因子STAT3和STAT5的磷酸化和转录激活。有趣的是，它们还会限制MDSC（髓源性抑制细胞）的扩增，抑制T淋巴细胞的激活。虽然这似乎与抑制T淋巴细胞的作用相反，但对抑制肿瘤作用也可以起到有益的作用，如在肿瘤微环境中，MDSCs可直接通过分泌促进肿瘤生长的因子来促进血管生成及淋巴管生成。黑树莓提取物不但可以通过抑制MDSCs导致的肿瘤血管生成，还被发现可以通过其他抗血管生成的机制来抑制血管生成，即从源头上抑制血管生成以及抑制血管原的血管生长，血管生长是通过基于组织的体外纤维蛋白凝胶进行测定的。
5.1. 上皮癌
致癌物BPDE（苯并[α]芘-7,8-二醇-9,10-环氧化物）可引起小鼠上皮CI41细胞系增殖，而相关的报道表明，黑树莓可抑制癌细胞的增殖。研究表明，黑树莓提取物具有化学预防作用，能够抑制BPDE诱导激活转录因子AP-1、NFκB、NFAT（活化T细胞的核因子）以及抑制相关基因如VEGF（血管内皮生长因子）、COX-2（环氧合酶2）和TNF-α（肿瘤坏死因子）的表达。已有许多种相关的假设机制来解释上述黑树莓的化学预防作用。一种是通过阻止MAPKs（丝裂原活化蛋白激酶）和IκBa（NFκB的抑制蛋白，一般以失活状态存在于细胞质中）的磷酸化及抑制AP-1和NFκB的活化受损，从而下调VEGF和COX-2。其他数据表明PI-3K/Akt信号转导通路的抑制，可能与抑制AP-1和NFκB的活化受损有关。奇怪的是，依赖于AP-1的iNOS的表达却没有被抑制。这些结果意味着黑树莓成分具有靶向作用于不同信号转导通路的潜力，从而发挥对上皮癌的化学预防作用。在后续研究中，发现抑制由BPDE诱导的NFκB活化作用的主要成分是矢车菊素-3-O-葡糖苷、-3-O-芸香糖苷和-3-O-木糖基芸香糖苷。
在一项SKH-1无毛小鼠的体内研究中，局部使用黑树莓提取物可显著减少皮肤炎症及其癌变。在短期模型中，将小鼠暴露于一定剂量的UV-B辐射下，小鼠出现了小范围的红斑，局部分别用黑树莓提取物或赋形剂处理。处理48小时后，用500μg黑树莓提取物处理的小鼠的炎症反应显著减少，包括皮肤水肿、中性粒细胞活化、p53的蛋白质表达水平和DNA损伤标志物都显著减少。在长期模型中，将小鼠暴露于相同剂量辐射，每周三次，持续25周，同时局部用黑树莓提取物及赋形剂处理，发现与用赋形剂处理的小鼠（每只小鼠平均有30个肿瘤，肿瘤的平均大小为30.2 mm2）相比，用黑树莓提取物处理的小鼠的肿瘤数及肿瘤大小（每只小鼠平均有17个肿瘤，肿瘤的平均大小为10.1 mm2）均有减少。这与肿瘤组织浸润的CD4+和CD3+ foxp3+T细胞的水平显着降低有关，而肿瘤组织浸润的CD4+和CD3+ foxp3+T细胞的水平会促进UV-B诱导的炎症反应和肿瘤发展。
5.2. 乳腺癌
在一个有关黑树莓对乳腺肿瘤作用的饮食管理活动报告中发现，与喂食标准饮食的大鼠相比，喂食了黑树莓或鞣花酸的大鼠中的肿瘤体积和多样性都减小了。这个报告中所用的大鼠属于ACI品系，乳腺肿瘤是由雌激素诱导的。并且，黑树莓提取物和鞣花酸在显著减少肿瘤体积和多样性方面具有类似的疗效。此外，黑树莓可以有效下调雌激素受体ERα的表达。在人体MCF-7乳腺癌细胞系的体外研究中，发现黑树莓提取物有可能使癌细胞对辐射损伤更加敏感。出现这种结果的原因应该是对NFκB的抑制作用，NFκB是癌细胞的一种辐射防护剂。
5.3. 口腔癌
在正常的、恶化前的及恶化的人口腔细胞上对黑树莓提取物的化学预防作用进行评估。黑树莓乙醇提取物可抑制恶性肿瘤细胞及癌变前细胞的生长，且对正常细胞没有影响。并且发现鞣花酸、阿魏酸和β-谷甾醇对这些细胞也有同样的效果，唯一的区别就是鞣花酸会抑制正常细胞的生长。鞣花酸的这种抑制作用可归因于其对细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）的影响，Cdk是一种在信号通路中可调节细胞周期进程的蛋白。在另一项口腔鳞状细胞癌（SCC）的研究中，发现黑树莓乙醇提取物有抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制VEGF产生及NOS活性的作用。
为研究黑树莓抑制口腔肿瘤的作用，采用7,12-二甲基苯基蒽诱导的致癌作用模型在仓鼠颊囊进行了实验。与对照组相比，喂食中有5％黑树莓粉末的仓鼠颊囊的肿瘤数量显著减少，然而，喂食10％黑树莓粉末抑制肿瘤生长的作用则不如5％的那么好。
5.4. 食道癌
研究黑树莓的作用大多采用N-亚硝基甲基苄胺（NMBA）诱导ESCC（食管鳞状细胞癌）的大鼠模型。在抗癌研究中，给实验大鼠分别喂食5％和10％的冻干黑树莓粉，发现冻干黑树莓粉可显著减少病灶形成、肿瘤发病率及多样性，从而证明黑树莓可以抑制癌症的发生及发展。有趣的是，5％剂量的黑树莓粉似乎比10％的更有效。其抑制病变的作用与在食管中减少NMBA诱导的前致癌物O6-甲基鸟嘌呤加合物中的影响有关，这说明黑树莓可影响NMBA的代谢，从而防止DNA的损伤。
后启动研究表明，黑树莓除了可以减少NMBA处理的大鼠中肿瘤病灶、数量及大小，还可把一些食管癌和食道乳头状瘤中异常表达的基因调节在正常水平。如表2（见22页）所示，与草莓的冻干提取物相比，黑树莓抑制NMBA诱导的DNA加合物形成更有效，同时还可减少肿瘤的发生率和多样性。从补充大鼠中获得了抑制食管组织培养及微粒体NMBA的有效成分，并被鉴定为矢车菊素-3-O-芸香糖苷、鞣花酸和矢车菊素-3-O-葡糖苷。
在另一项研究中，发现黑树莓提取物包括富含花色苷部分和有机不溶部分（预估含有大量单宁）可抑制癌以及癌前病变中的细胞增殖、炎症、血管生成，这表明了黑树莓抑制不同类型的癌症的作用机制是相似的。此外，研究还发现，含有冻干黑树莓、黑树莓的花色苷及原儿茶酸（主要花色苷代谢产物）的饮食均可同等有效地抑制NMBA诱导的食管肿瘤，然而在35周以后的实验中发现，还是冻干黑树莓粉的效果会略微更好一些。
然而，在一项黑树莓、草莓和蓝莓即不同含量的单宁对大鼠食管癌影响的研究中发现，浆果部分组防止NMBA诱导ESCC的作用并没有显著性差异。这表明黑树莓中的单宁可能并没有化学预防作用。
对食管鳞状细胞癌的肿瘤进展的分子机制研究显示，饮食中加入5％黑树莓粉末可下调食管癌癌前病变中COX-2、iNOS、PGE2和c-Jun（AP-1蛋白家族成员）的mRNA和蛋白质的表达水平。黑树莓提取物也被证明具有抗血管生成特性，可显著抑制食管癌癌前病变中VEGF的表达，还可减少微血管密度（MVD），这都与抑制COX-2和iNOS有关。
此外，黑树莓粉还能通过降低促炎生物标志物COX-2、iNOS、p-NF-κB，可溶性环氧化物水解酶和细胞因子正五聚蛋白-3的活性抑制食管内皮炎症，上述的生物标志物是由IL-1b和TNF-α介导的。
5.5. 结直肠癌
关于黑树莓对COX-2表达而影响HT-29结肠癌细胞的报道并不少。在几种浆果提取物对抗HT-29结肠癌细胞促进细胞凋亡活性的研究中，黑树莓提取物是有显著促凋亡活性作用的两种浆果之一（另一种是草莓），且其诱导细胞的效果是未经处理对照组的3倍。其他有关HT-29细胞抗增殖的报道中显示，虽然黑树莓提取物抑制癌细胞增殖存在剂量依赖性，但其抑制增殖的效果与总酚及总花色苷含量并没有相关性。为了进一步探讨这个问题，采用了基于1H NMR多变量统计模型的代谢组学研究来鉴定天然黑树莓提取物中具有抗增殖活性的成分。发现，具有抗增殖活性的主要成分是矢车菊素-3-O-木糖基芸香糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷。然而，该模型数据还指出，黑树莓的抗增殖功效并非直接与花色苷含量相关。这和之前的研究报告一致，花色苷可对癌细胞起到最大的作用，然而总花色苷含量的提高或种类分布的改变可能都不会提高提取物的活性。黑树莓中的非花色苷成分虽然只占了总酚含量非常小的比例，但对黑树莓提取物的抗增殖活性也非常重要，这些成分包括水杨酸衍生物、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-芸香糖苷、对香豆酸、表儿茶素、甲基鞣花酸衍生物和柠檬酸衍生物。此外，研究还发现黑树莓中的花色苷能抑制DNA甲基转移酶的活性及表达，DNA甲基转移酶对一些人体特定肿瘤包括HTC-116中的DNMT1、DNMT3B以及结肠直肠腺癌细胞系中的Caco-2、SW480的异常甲基化具有重要意义。这些结果表明黑树莓中的花色苷对全黑树莓在结直肠癌中的去甲基化作用是极具意义的。
溃疡性结肠炎是一种可显著增加结直肠癌风险的慢性溃疡性结肠炎（UC），科学家们采用
3％葡聚糖硫酸钠（DSS）诱发溃疡性结肠炎（UC）的小鼠模型评价冻干黑树莓的化学预防效果。研究发现，饮食中丰富的黑树莓粉末可显著减少DSS引起的损伤包括结肠缩短及溃疡，然而，这并没有影响到氧化应激生物标志物（血浆NO和结肠丙二醛）的水平以及和结肠DSS损伤有关的炎性细胞浸润。另一方面，7天的黑树莓粉治疗可抑制结肠组织中TNF-α、IL-1b、COX-2及IκB-α的磷酸化（IκB-α磷酸化后随即降解，随之而来的就是NFκB核因子的激活）。奇怪的是，这项研究的结果表明黑树莓的保护机制更多与其抗炎特性而不是抗氧化活性相关。
还有一些其他的大肠癌动物模型运用于评价黑树莓在体内的功效。化学致癌物氧化偶氮甲烷
（AOM）能够诱发大鼠结直肠癌的发生，该动物模型被广泛用于一些化学预防剂预防结肠癌的作用评价。喂食含有2.5％、5％、10％的冻干黑树莓粉末的大鼠肿瘤多样性分别降低42％、45％和71％，同时可显著减少暴露于AOM的大鼠的DNA氧化损伤，降低尿中的DNA氧化损伤生物标志物8-OH-Dg的表达。
两种基因缺陷小鼠模型APC1638+/-及Muc-/-，可分别自发发展成结直肠癌及结肠炎，可用于评
价黑树莓对结肠癌发展的影响及其潜在机制。在两种模型中，喂饲黑树莓12个星期可显著抑制结直肠肿瘤的发生。APC1638+/-小鼠肿瘤发生率减少45%，单只肿瘤数量减少60%；Muc-/-小鼠的发生率和单只肿瘤数量则都是减少50%。机理研究结果表明，黑树莓可通过抑制β-catenin信号通路（其过度表达与多种类型的癌症相关）抑制APC1638+/-小鼠肿瘤发展，抑制Muc-/-小鼠肿瘤发展则是通过减少慢性炎症。
6. 黑树莓果肉的早期化学预防临床试验
黑树莓是基于食物的癌症预防途径，科学们已经做出了相当大的努力来评估黑树莓粉作为化学预防剂的效用。黑树莓在最小或无毒性的条件下限制了癌前细胞转化为恶性癌细胞，这种特性使其极有希望成为早期化学预防剂。一项研究为了确定黑树莓对口腔癌的发展具有是否保护作用，将含有冻干黑树莓的粘膜粘附凝胶局部施用于人类口腔粘膜。上皮内瘤样病变患者易患口腔鳞状细胞癌，每日给皮内瘤样病变患者施用黑树莓凝胶4次，为期6周。6周后，在施用黑树莓凝胶的患者中观察到病变组织的退化，在3个肿瘤抑制基因位点：UK4A/ARF、p53和FHIT中观察到杂合性缺失率在统计学上显著降低。此外，还发现用黑树莓凝胶治疗后可显著降低病变上皮中COX-2的水平。在研究过程中，一部分患者对黑树莓凝胶的响应很好。病灶上的蛋白质谱显示，这些高度响应的患者体内的黑树莓代谢和角质形成细胞分化所需的酶的预处理水平更高，这表明在黑树莓治疗中，自己体内的酶活力也是很重要的。
接下来要介绍的这个课题是对口腔内花色苷代谢及其对黑树莓化学预防功效潜在影响的后续研究。每天给患者局部施用10%黑树莓，通过患者的漱口液来评估口腔组织、唾液和口腔菌群中花色苷的代谢水平。通过大量的药代动力学分析和功能活性测定，证明黑树莓中的花色苷在唾液中可持续性存在，并且漂洗黑树莓外用凝胶时，口腔中的花色苷水平更高，还发现原儿茶酸（稳定的花色苷降解产物）及原儿茶酸葡萄糖苷、葡糖醛酸化的花色苷缀合物（被认为是生物活性花色苷代谢物）在唾液中也可持续存在。这种肠溶性花色苷的循环过程，很大程度上是被口腔的β-葡萄糖苷酶催化发生的，并且患者间的个性化也可能影响局部施用黑树莓化学疗法的效果。
一项研究对结直肠癌及结直肠息肉患者进行了黑树莓的干预试验，患者均是在预定手术的前2-4周接受了每天60g干黑树莓粉的治疗。比较治疗前后肿瘤/息肉组织的活检结果发现，黑树莓粉对结直肠癌的两种预后生物标志物有影响：Ki-67和CD105。在活检标本中发现，Ki-67蛋白（与细胞增殖相关）和CD105（这是TGF-β受体复合物的一部分，并在血管生成中具有关键作用）的水平在黑树莓治疗后均显著降低。并且，用TUNEL法检测DNA片段化结果显示，用黑树莓治疗后的肿瘤细胞凋亡率升高。
在一项为期9个月的针对家族性腺瘤性息肉病高危患者试验中，14名患者每天采用两种不同的黑树莓粉治疗方式，一种是口服黑树莓粉+BRB直肠栓剂的形式，另一种则是口服安慰剂+BRB直肠栓剂。结果发现，对黑树莓治疗有响应的患者息肉负荷显著下降，但息肉数量并没有下降，同时这些患者还有其他变化：细胞增殖率下降，DNMT1表达减少，CDKN2A的甲基化下降。其中，CDKN2A是抑癌基因p16的启动子基因。有3例患者对黑树莓的治疗无反应，他们的腺瘤数目或分子标志物水平基本没有变化。
在另一项关于结直肠癌的研究中，患者每天接受60g黑树莓粉，为期9周，并抽血检测细胞凋亡、细胞增殖和血管生成的相关标志物的变化。结果表明，浆果治疗对腺癌及邻近未分化组织的增殖（Ki67）、凋亡（TUNEL）、血管生成（CD105）都具有积极的作用。同时，患者接受浆果治疗10天后，血浆中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）浓度显著升高，IL-8浓度显著降低，其他血浆细胞因子则无明显变化。由于IL-8的高水平表达是肿瘤发展的一个强有力的预测因子，因此作者提出IL-8和GM-CSF的变化可以作为结直肠癌患者消费黑树莓治疗反应的预测指标。
一项在巴雷特食管的癌前病变患者中进行的研究显示，尽管尿液中检测的氧化应激生物标志物的水平显著降低，但巴雷特食管病灶的病变长度并没有显著改变。作者认为，这可能是当黑树莓粉混合水后以悬浮液形式施用时，因为通过食管速度太快，还不足以让局部充分吸收活性化合物进入病灶。
7.总 结
黑树莓具有独特的多酚成分，主要由花色苷和鞣花单宁组成。黑树莓的果肉具有很高的抗氧化性，且发现其在分子水平上可减少与癌症和炎症相关的过程。黑树莓通过影响致癌物质代谢、降低癌前细胞的生长速度、促进细胞凋亡、减少组织炎症和抑制血管生成等机制对多种类型肿瘤均有一定的抑制作用。动物和体外研究的结果使得黑树莓成为肿瘤早期化学预防的一种有前景的物质，但是，黑树莓的作用在临床试验中并没有得到非常明确的肯定。
花色苷似乎是黑树莓化学预防活性的主要贡献者，但关于黑树莓果肉有效成分的生物利用度和代谢的相关研究则很少。花色苷的生物利用度较低（血浆＜1%），但已有研究发现在口腔和结肠组织中存在其天然形式，提示它们可能可以通过消化道与消化道组织相互作用。另一个存在的问题是不同患者对多酚摄入的估计量及其比较不易进行，因为这可能存在很大的个体差异性，这种个体差异性与多个因素有关，如肿瘤部位附近的分子信号、自身体内酶的活性和微生物群。
在目前采用的临床试验方法中也存在一些明显的不足。这些临床试验通常是短时间完成的，并且患者人数较少，这些临床试验并不能提供足够的关于长期改善慢性疾病的数据。因此，在黑树莓化学预防研究中需要考虑更多人体长期的临床试验。临床试验中的另一个问题是患者对治疗的反应，这与患者体内生物活性浆果成分的代谢及吸收速率有关，一些研究人员确定了识别非侵入性生物标志物的必要性，这些生物标志物可以预测更有可能从化学预防治疗中受益的个体。
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